Caractérisation structurale et fonctionnelle de la sous-unité périplasmique TaKP d'un transporteur TRAP chez Rhodobacter sphaeroides

par Sophie Gonin

Thèse de doctorat en Microbiologie moléculaire et biotechnologies

Sous la direction de David Pignol.

Soutenue en 2008

à Aix Marseille 2 .


  • Résumé

    Les transporteurs TRAP sont de type actif secondaire, et sont composés de trois sous-unités, parmi lesquelles deux sont membranaires. La troisième sous-unité est soluble dans le périplasme chez les bactéries Gram négatif. Elle est également appelée ESR (Extracytoplasmic Solute Receptor) car elle fixe le composé importé. Ces transporteurs sont peu caractérisés à ce jour. Cette thèse est consacrée à l’étude structurale et fonctionnelle de l’ESR du transporteur TRAP TakPQM chez les deux souches Rhodobacter sphaeroides f. Sp. Denitrificans IL106 et Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1. Le phe��notype d’un mutant de transposition de la souche IL106 nous a d’abord conduits à faire l’hypothèse d’un lien possible entre l’ESR TakP et l’import de sélénite. La caractérisation du phénotype d’un mutant de délétion nous a ensuite permis d’infirmer cette hypothèse. Par ailleurs, par le phénotypage de mutants de délétion et le suivi in vitro des interactions protéine-soluté par spectrométrie de fluorescence, nous avons montré que TakP de 2. 4. 1 fixe le pyruvate. Nous avons cristallisé la protéine et obtenu la structure tridimensionnelle de TakP de 2. 4. 1 par diffraction des rayons X, en absence et en présence de pyruvate. Cette structure d’ESR est la première montrant une structure quaternaire dimérique. La fixation du substrat se fait par l’intermédiaire d’un ion sodium, pouvant avoir un rôle dans l’énergisation du transport. Enfin, grâce au même type d’expériences répétées sur des mutants et sur la protéine TakP de la souche IL106, les résultats obtenus suggèrent un rôle de TakP dans l’import d’α-cétoglutarate et non de pyruvate pour cette souche. TakP de IL106 et de 2. 4. 1 ne se différencient que par 4 acides aminés, dont l’un (l’arginine 242 chez IL106 et la glycine 242 chez 2. 4. 1) se situe à la charnière des deux domaines de la protéine et pourrait être impliqué indirectement dans la spécificité de substrat. Nous avons validé cette hypothèse en montrant que le mutant R242G de TakP IL106 est capable in vitro de fixer le pyruvate contrairement à la protéine sauvage.

  • Titre traduit

    Characterization of the structure and function of the periplasmic subunit TaKP of a TRAP transporter in Rhodobacter sphaeroides


  • Résumé

    TRAP transporters are secondary active transporters. They are composed of three subunits, two of which are inserted in the membrane. The third one is soluble in the periplasm of Gram negativ bacteria, and is also called ESR (Extracytoplasmic Solute Receptor) because it binds the compound to be imported. These transporters are poorly characterized to date. This work aims at characterizing the structure and function of the ESR from the TRAP transporter TakPQM in the two strains Rhodobacter sphaeroides f. Sp. Denitrificans IL106 and Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1. According to the phenotype of a transposition mutant of the strain IL106, we first made the hypothesis that there was a link between the ESR TakP and selenite import. The phenotypic characterization of a deletion mutant enabled us to finally reject this hypothesis. Furthermore, by studying the phenotype of deletion mutants and solute-protein interactions in vitro by fluorescence spectroscopy, we demonstrated that TakP from 2. 4. 1 binds pyruvate. We cristallised the protein and obtained the tridimensional structure of TakP from 2. 4. 1 by X-ray diffraction, alone or in the presence of pyruvate. This ESR structure is the first one to show a dimeric quaternary fold. The binding of the substrate is mediated by a sodium ion which could play a part in the transport energisation. Eventually, we repeated the same type of experiments on deletion mutants and on the protein TakP from strain IL106, which results indicate that TakP from IL106 binds α-ketoglutarate and not pyruvate. Only four amino acids differ between TakP from IL106 and from 2. 4. 1, and one of them (arginine 242 in IL106 and glycine 242 in 2. 4. 1) is part of the hinge between the two domains of TakP and could indirectly interfere in its substrate specificity. We have shown that the mutant R242G of TakP IL106 is able to bind pyruvate in vitro, contrary to the wild-type protein.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (162 p. )
  • Annexes : Bibliogr. p.147-162

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  • Bibliothèque : Université Aix-Marseille (Marseille. Luminy). Service commun de la documentation. Bibliothèque de sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 47725
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