Dosage de l'activité endoprotéolytique de neurotoxines clostridiales

Detection of endoproteolytic activity of clostridial neurotoxins

• Auteur / Autrice : Séverine Marconi
• Direction : Nicole Martin-Moutot
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance en 2008
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 2
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de neurobiologie des canaux ioniques (Marseille)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Vésicules synaptiques

Protéines membranaires

Agents neurotoxiques

Toxines botuliques

Résonance plasmonique de surface

Toxines botuliniques

Résumé

L’utilisation croissante des neurotoxines botuliques comme agents thérapeutiques et cosmétiques mais aussi le risque qu’elles constituent en tant qu’armes biologiques potentielles nécessitent l’élaboration de nouveaux tests de détection de leur activité protéolytique in vitro, pour remplacer à terme le test de référence de létalité in vivo chez la souris. Un dosage in vitro de l’activité des BoNT/B par résonance plasmonique de surface (SPR, mis au point par Ferracci et al. En 2005, est basé sur la quantification directe de la VAMP2, protéine des vésicules synaptiques, par son immuno-capture sur des anticorps spécifiques immobilisés sur la sensor chip. Ce test est 200 fois plus sensible et jusqu’à 25 fois plus rapide que le test de référence in vivo. Le clivage de la VAMP2 des vésicules synaptiques par la BoNT/B a été estimé par SPR, ELISA et cytométrie de flux. Les EC50 déterminés sont similaires entre les trois méthodes alors que l’analyse SPR est beaucoup plus rapide et économique. D’autre part, les VS constituent un substrat très robuste, lyophilisable, permettant de détecter l’activité enzymatique de la BoNT/B dans des milieux complexes. L’utilisation d’un protocole d’immunoisolation de la BoNT/B dans le sérum rend le test 30 fois plus sensible que la méthode in vivo. Nous avons développé une méthode SPR permettant la quantification de protéines de la membrane plasmique et le dosage de l’activité de la BoNT/A. Des antigènes membranaires intracytoplasmiques, dont la SNAP-25 (cible de la BoNT/A), ont été dosés sans solubilisation avec une sensibilité de l’ordre du picogramme. En utilisant un anticorps reconnaissant spécifiquement la SNAP-25 clivée par la BoNT/A, nous avons établi une méthode de dosage rapide et sensible de ce sérotype. La méthode a été appliquée au dosage de l’activité de la BoNT/A dans des cultures cellulaires en 24 ou 96 puits.

Neurotransmitter-filled synaptic vesicles fuse in a calcium-dependent manner with the plasma membrane to release their content into the synaptic cleft. VAMP2, a synaptic vesicle membrane protein, interacts with SNAP-25 and syntaxin1 localized on the plasma membrane. These proteins, called SNAREs, assemble into a heterotrimeric complex that brings the vesicle and the plasma membranes into close apposition. Botulinum neurotoxins (BoNTs), the most toxic biological substances known, inhibit synaptic neurotransmission by cleaving SNAREs. There are seven BoNT serotypes named A to G of which BoNT/ B and F cleave VAMP2 and BoNT/A and E cleave SNAP-25. The increasing use of BoNTs as therapeutic and cosmetic agents, but also the threat they constitute as potential bioweapons, highlight the need for development of in vitro assays to detect their endoproteolytic activity. These alternative methods should replace the mouse bioassay which is the current reference method. An in vitro assay for the detection of the catalytic activity of BoNT/B and F has been developed by Ferracci et al. In 2005. It is based on the direct quantification of synaptic vesicle proteins, in particular VAMP2, by their immuno-capture on specific antibodies immobilized on the sensor chip surface. For BoNT/B, this test was shown to be 200 times more sensitive and up to 25 times faster than the reference in vivo toxicity test in mice. Using synaptic vesicles as a substrate, a comparison of the EC50s for BoNT/B obtained by SPR, ELISA or flow cytometry indicated similar sensitivity although SPR assays were more rapid and economical. We also showed that synaptic vesicles are a robust substrate, that can be lyophilized, allowing the detection of BoNT/B activity in complex media. With an immunoisolation step of BoNT/B from serum, the assay was shown to be 30 times more sensitive than the mouse bioassay. We developed an SPR-based method allowing the quantification of plasma membrane proteins and the detection of BoNT/A activity. Sonication of brain or neuronal cultures generated plasma membrane fragments with accessible intra-cellular epitopes adapted to analysis by SPR. SPR responses were proportional to antigen concentration permitting detection of as little as 4 pM SNAP-25 in crude lysates. BoNT/A activity was assayed using monoclonal antibodies that specifically recognize a SNAP-25 epitope generated by the proteolytic action of the toxin. The SPR biosensor method was sensitive enough to monitor BoNT/A and B activity in cells cultured in a 96-well format and could favourably replace time-consuming techniques for the measurement of toxin activity.