Dosage de l'activité endoprotéolytique de neurotoxines clostridiales

par Séverine Marconi

Thèse de doctorat en Neurosciences

Sous la direction de Nicole Martin-Moutot.

Soutenue en 2008

à Aix Marseille 2 .

  • Titre traduit

    Detection of endoproteolytic activity of clostridial neurotoxins


  • Pas de résumé disponible.


  • Résumé

    L’utilisation croissante des neurotoxines botuliques comme agents thérapeutiques et cosmétiques mais aussi le risque qu’elles constituent en tant qu’armes biologiques potentielles nécessitent l’élaboration de nouveaux tests de détection de leur activité protéolytique in vitro, pour remplacer à terme le test de référence de létalité in vivo chez la souris. Un dosage in vitro de l’activité des BoNT/B par résonance plasmonique de surface (SPR, mis au point par Ferracci et al. En 2005, est basé sur la quantification directe de la VAMP2, protéine des vésicules synaptiques, par son immuno-capture sur des anticorps spécifiques immobilisés sur la sensor chip. Ce test est 200 fois plus sensible et jusqu’à 25 fois plus rapide que le test de référence in vivo. Le clivage de la VAMP2 des vésicules synaptiques par la BoNT/B a été estimé par SPR, ELISA et cytométrie de flux. Les EC50 déterminés sont similaires entre les trois méthodes alors que l’analyse SPR est beaucoup plus rapide et économique. D’autre part, les VS constituent un substrat très robuste, lyophilisable, permettant de détecter l’activité enzymatique de la BoNT/B dans des milieux complexes. L’utilisation d’un protocole d’immunoisolation de la BoNT/B dans le sérum rend le test 30 fois plus sensible que la méthode in vivo. Nous avons développé une méthode SPR permettant la quantification de protéines de la membrane plasmique et le dosage de l’activité de la BoNT/A. Des antigènes membranaires intracytoplasmiques, dont la SNAP-25 (cible de la BoNT/A), ont été dosés sans solubilisation avec une sensibilité de l’ordre du picogramme. En utilisant un anticorps reconnaissant spécifiquement la SNAP-25 clivée par la BoNT/A, nous avons établi une méthode de dosage rapide et sensible de ce sérotype. La méthode a été appliquée au dosage de l’activité de la BoNT/A dans des cultures cellulaires en 24 ou 96 puits.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (133 p.)
  • Annexes : Bibliogr., 310 réf.. Index

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  • Bibliothèque : Université d'Aix-Marseille (Marseille. Timone). Service commun de la documentation. Bibliothèque de médecine - odontologie.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : T2008/AIX2/0690Ubis
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