Mise en place d'un système de transfert de gènes et de regénération de plantes in vitro pour l'étude de la régulation du métabolisme des alcaloïdes chez Catharanthus roseus (L. ) G. Don : application au promoteur de la déacétylvindoline 4-0-acétyltransférase

par Abdullah Barakat Makhzoum

Thèse de doctorat en Pharmacie. Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Benoît Saint-Pierre et de Geneviève Petit-Paly.

Soutenue en 2007

à Tours .


  • Résumé

    Cette thèse présente la première analyse fonctionnelle du promoteur du gène de la déacétylvindoline 4-O-acétyltransférase (dat) chez Catharanthus roseus, la pervenche de Madagascar. DAT catalyse la dernière étape de la biosynthèse de la vindoline. Cet alcaloïde indolique monoterpénique est l’un des précurseurs de la vinblastine et de la vincristine, les alcaloïdes dimères anticancéreux. Ce gène s’exprime de manière cellule-spécifique dans les idioblastes et les laticifères des feuilles et des jeunes fleurs. La spécificité de l’expression exige un système différencié au niveau tissulaire et cellulaire. C’est la raison pour laquelle, son expression est bloquée dans les suspensions cellulaires. Afin de comprendre sa machinerie de régulation transcriptionnelle, nous avons tenté d’établir un système de formation de tiges feuillées compatible avec un système de transfert de gène. Pour ce but, plusieurs systèmes de formation de tiges feuillées à partir de cotylédons, d’hypocotyles et de méristèmes ont été étudiés. Le méristème est l’explant le plus promoteur pour former des tiges feuillées sans passer par un stade de cal. Cependant, l’obtention de plantes transgéniques à partir des hypocotyles et cotylédons n’a pas été possible tandis que le méristème a conduit à la formation de tissus transformés chimériques. De plus, les tentatives d’engendrer des tiges feuillées à partir de chevelus racinaires ont donné des structures chlorophylliennes organisées. Des fragments de 812 pb et 2,3 kb de la région 5’ en amont du gène dat ont été fusionnés au gène rapporteur GusPlus avec ou sans la région codante du gène dat. Ces constructions ont été analysées par agroinfiltration dans des plantules et divers organes de C. Roseus et par transformation stable dans le tabac. Ces constructions ont démontré une certaine organo-spécificité dans les parties aériennes mais pas une régulation cellulaire-spécifique sauf pour la fusion promoteur dat-région codante dat qui possède une spécificité cellulaire dans le système hétérologue. Dans ce cas, l’expression ectopique du gène GusPlus a été localisée dans les tissus conducteurs et dans les cellules de garde des stomates. Les analyses in silico ont permis d’identifier de nombreux éléments cis-régulateurs putatifs dans la région 5’ et dans la région codante. Des facteurs de types DOF ont été détectés dans la région codante en plusieurs positions. Ces facteurs seraient impliqués dans la régulation des gènes de défense et des gènes exprimés dans les cellules de garde des stomates. Cette étude illustre le rôle de l’intégration du transgène dans le génome et des éléments de régulation dans la région codante pour établir la régulation cellulaire-spécifique des gènes.

  • Titre traduit

    Establishment of gene transfer and in vitro plant regeneration systems to study the regulation of alkaloid metabolism in catharanthus roseus (L. ) G. Don : application to the study of deacetylvindoline 4-0-acetyltransferase promoter


  • Résumé

    This thesis focuses on functional analysis of deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase (dat) gene promoter in Catharanthus roseus (Madagascar periwinkle). DAT catalyze the last step in vindoline biosynthesis. This monoterpenoid indole alkaloid is a precursor of the bisindole anticancer drugs vinblastine and vincristine. The expression of DAT gene is known to be restricted to specific cell types called idioblast and laticifer in young leaves and flowers. In order to decipher the element controlling dat gene transcription, we attempted to establish a gene transfer system in differentiated tissues where this gene is expressed. Shoot regeneration system was established using hypocotyls, cotyledons and meristems. Transient expression of glucuronidase reporter gene was demonstrated in these explants following T-DNA gene transfer by disarmed Agrobacterium tumefaciens bearing pCAMBIA1305. 1. However, selection of hygromycin-resistant stable transformant was not successful from cotyledons and hypocotyls explants while chimerical tissues were obtained from meristems. Furthermore, our attempt to regenerate organized tissue using virulent Agrobacterium rhizogenes allowed us to obtain chlorophyllian organized tissues. To analyze the cell-type specific mechanism of regulation, 812bp and 2,3 kb of dat 5’ upstream sequences were fused to the GusPlus reporter gene, with or without dat coding sequences. These constructions were tested by transient expression in organs of C. Roseus following agro¬infiltration and by stable transformation in tobacco. The reporter gene in these constructs demonstrated organ-specificity but not cell specific expression except for the dat promoter-coding region fusion that shows a cell specific expression in the heterologous system. Ectopic expression was localized in stomata guard cells. In silico analysis revealed many putative cis-acting regulatory elements in upstream and downstream dat regions. Binding sites for DOF transcription factors were detected in dat coding region. These factors have been reported to participate in the regulation of gene expression in many processes such as plant defence mechanism and stomata guard cell specific gene regulation. These results illustrate the role of transgene integration in the genome and the role of regulatory elements in the coding region to establish a cellular-specific gene regulation.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (137 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 118-137.

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  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TPH-2007-TOUR-3802

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  • Cote : 2007TOUR3802
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