Conception et obtention d'un anticorps spécifique des formes activées des Rho GTPases

par Marine Goffinet

Thèse de doctorat en Cancérologie

Sous la direction de Gilles Favre et de Jean-Charles Faye.

Soutenue en 2007

à Toulouse 3 .


  • Résumé

    Les protéines Rho A, B et C dont l'activité est régulée par l'échange GDP/GTP seraient impliquées dans la tumorigenèse. Même si la surexpression dans les tumeurs des protéines Rho est largement démontrée et qu'il est établi que seule la forme activée est capable d'entraîner la transmission des signaux, seules quelques études ont corrélé l'activation des protéines Rho à la gravité des cancers. Nous avons identifié par " phage display " un scFv (C1) capable de distinguer spécifiquement la conformation activée (liée au GTP) des protéines Rho A, B et C. L'anticorps soluble C1 exprimé en fusion avec la partie N-terminale de la protéine pIII du phage (C1-N1N2) s'associe spécifiquement aux protéines Rho activées endogènes des cellules HeLa (immunofluorescence). Cette propriété originale permettra, en association avec les anticorps non conformationnels anti-RhoA et anti-RhoB d'analyser l'activation des Rho dans le développement tumoral.

  • Titre traduit

    Identification of a GTP-bound Rho specific scFv molecular sensor by phage display selection


  • Résumé

    The Rho GTPases A, B and C proteins, members of the Rho family whose activity is regulated by GDP/GTP cycling, function in many cellular pathways controlling proliferation and have recently been implicated in tumorigenesis. Although overexpression of Rho GTPases has been correlated with tumorigenesis, only their GTP-bound forms are able to activate the signalling pathways implicated in tumorigenesis. Thus, the focus of much recent research has been to identify biological tools capable of quantifying the level of cellular GTP-bound Rho, or determining the subcellular location of activation. However useful, these tools used to study the mechanism of Rho activation still have limitations. The aim of the present work was to employ phage display to identify a conformationally-specific single chain fragment variable (scFv) that recognizes the active form of Rho GTPases and is able to discriminate the activated (GTP bound) form of Rho in endogenous settings. After five rounds of phage selection using a constitutively activated mutant of RhoB (RhoBQ63L), three scFvs (A8, C1 and D11) were selected for subsequent analysis. Further biochemical characterization was pursued for the single clone, C1, exhibiting an scFv structure. C1 was selective for the GTP-bound form of RhoA, RhoB, as well as RhoC, and failed to recognize GTP-loaded Rac1 or Cdc42, two other members of the Rho family. Soluble C1 expressed in fusion with the N-terminal of phage protein pIII (scFv C1-N1N2) specifically associated with GTP-loaded recombinant RhoA and RhoB via immunoprecipitation, and endogenous activated Rho in HeLa cells as determined by immunofluorescence. We identified an antibody, C1-N1N2, specific for the GTP-bound form of RhoB from a phage library, and confirmed its specificity towards GTP-bound RhoA and RhoC, as well as RhoB. The success of C1-N1N2 in discriminating activated Rho in immunofluorescence studies implies that this new tool, in collaboration with currently used RhoA and B antibodies, has the potential to analyze Rho activation in cell function and tumor development.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (165 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 156-164

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  • Bibliothèque : Université Paul Sabatier. Bibliothèque universitaire de sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2007TOU30143
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