Development of multidimensional liquid chromatographic methods hyphenated to mass spectrometry : Preparation and analysis of complex biological samples

par Nathanaël Delmotte

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Alain Van Dorsselaer et de Christian Huber.

Soutenue en 2007

à Strasbourg 1 en cotutelle avec l'Universität des Saarlandes - Saarbrücken - Allemagne .

  • Titre traduit

    Développement de méthodes chromatographiques liquides multidimensionnelles couplées à la spectrométrie de masse : Préparation et analyse d’échantillons biologiques complexes


  • Résumé

    Des immunoadsorbeurs ont été développés à partir de disques CIM monolithiques pour l’analyse de biomarqueurs impliqués dans des maladies cardio-vasculaires. Les colonnes développées ont permis d’isoler sélectivement la myoglobine et le NT-proBNP du sérum humain. Les colonnes anti-NT-proBNP ont permis l’isolation quantitative du NT-proBNP (R2 = 0,998) à des concentrations jusqu’à 750 amol/μL de sérum. Six matériaux à accès restreints ont été évalués en fonction de leur aptitude à exclure l’hémoglobine d’hémolysats sanguins. Des injections à différents pH ont montré que la rétention de l’hémoglobine est drastiquement restreinte à pH 10,7. En raison d’une bonne stabilité à pH basique, la colonne polymérique Biotrap 500 MS RAM a été retenue pour l’extraction d’antibiotiques d’hémolysats sanguins. Des extractions quantitatives d’analytes à faibles concentrations (200 pg/μL) ont été réalisées sans effet mémoire d’hémoglobine sur la colonne. Un nouveau système 2D-HPLC-ESI-MS/MS pour l’analyse protéomique a été développé. Le système est composé d’une séparation par RP-HPLC à pH 10,0, suivie d’une séparation par IP-RP-HPLC à pH 2,1. Ce nouveau système a été comparé à un système conventionnel SCX x IP-RP-HPLC. L’orthogonalité des méthodes de séparation est plus élevée dans l’approche SCX x IP-RP-HPLC que dans le schéma RP x IP-RP-HPLC. Cependant, en raison d’une meilleure distribution des peptides et d’une meilleure efficacité de séparation, le système RP x IP-RP-HPLC permet d’identifier significativement plus de peptides. Les deux approches sont complémentaires et une combinaison des deux systèmes permet d’identifier plus de peptides que des analyses répétées par un système unique.


  • Résumé

    Immunoadsorbers based on monolithic epoxy-activated CIM disks have been developed in order to target biomarkers of heart diseases. The developed immunoadsorbers permitted to selectively isolate myoglobin and NT-proBNP from human serum. Anti-NT-proBNP-CIM disks permitted a quantitative isolation of NT-proBNP at concentrations down to 750 amol/μL in serum (R2 = 0. 998). Six different restricted access materials have been evaluated with respect to their ability to remove hemoglobin from hemolysates. Experiments at different pH revealed that the retention of hemoglobin can be drastically diminished at pH 10. 7. Because of better chemical stability at high pH, the polymeric Biotrap 500 MS RAM column was optimized for the analysis of hemolysates. The setup permits to quantitatively extract antibiotics from whole blood hemolysates at biologically relevant concentrations (200 pg/μL), and without carry-over of hemoglobin. A new 2D-HPLC-ESI-MS/MS setup for proteome analysis was developed. It consisted of a peptide separation by RP-HPLC at pH 10. 0, followed by IP-RP-HPLC at pH 2. 1. This new setup was compared with a classical SCX x IP-RP-HPLC setup. Separation repeatability is similar with both setups. The orthogonality between methods of separation is higher in the SCX x IP-RP-HPLC approach than in the RP x IP-RP-HPLC scheme. However, the better peptide distribution and separation efficiency achieved with the RP x IP-RP-HPLC setup permitted to identify significantly more peptides than with the classical SCX x IP-RP-HPLC setup. Both approaches are complementary and a combination of both setups permits to identify more peptides than replicate injections performed with a single setup.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (205 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 180-188

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  • Accessible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2007;5412
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