Enzymatic and chromatigraphic determination of microcystins

par Dorota Szydlowska

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Jean-Louis Marty et de Marek Trojanowicz.

Soutenue en 2007

à Perpignan .

  • Titre traduit

    Détection de microcystines à l'aide de méthodes enzymatique et chromatographique


  • Résumé

    L’objectif de cette thèse était de développer une méthode analytique pour la détection des microcystines (MCs), heptapeptide cyclique produit par des cyanobactéries. La stratégie utilisée a été la mise au point d’un biocapteur ampérométrique base sur l’inhibition de protéines phosphatase (PP1 et PP2A) par les MCs. Plusieurs matériels d’électrodes ont été caractérisés: les électrodes de graphite ont été choisies à cause de leurs propriétés. L’encapsulation dans des polymères photos polymérisables ont démontré le meilleur rendement d’immobilisation et la meilleure activité. Plusieurs substrats phosphorylés ont été synthétisés. C’est le catéchol mono phosphate qui a permis d’obtenir les meilleures réponses à de faibles potentiels. Les droites d’étalonnage pour les micocystines MC-LR et MC-RR ont été réalisées. Des échantillons réels de cyanobactéries ont été analyses et leurs résultats corrélés avec la méthode colorimétrique et la chromatographie liquide haute performance (CLHP) avec détection UV. La seconde stratégie a été l’CLHP avec détection par fluorescence. Trois méthodes de dérivatisation ont été testées, mais aucune d’entre elles n’a permis d’obtenir des composés fluorescents stables. La dernière stratégie est basée sur l’électrophorèse capillaire avec détection UV. Cette dernière méthode permet la séparation et la détection de 3 microcystines différentes en 4 minutes avec des LODs de 2,13, 2,48 et 2,82 µg/L pour les MC-LR, MC-YR et MC-YA. La chromatographie électrocinétique micellaire a permis de séparer en 12 min, avec des LODs de 2. 83, 3. 74 et 2. 91 µg/L, les MC-LR, MC-YR et MC-YA, Ces deux dernières approches ont été testées sur des échantillons environnementaux.


  • Résumé

    The goal of this thesis was to develop analytical approaches for the detection of microcystins (MCs), cyclic heptapeptide compounds produced by cyanobacteria in water. The first strategy was an amperometric biosensor based on the inhibition of protein phosphatases type 1 and 2A (PP1 and PP2A) by MCs. Several electrode materials were characterised; screen-printed graphite electrodes were chosen due to their appropriate properties. Several enzyme immobilisation methods were tested, the encapsulation into photopolymers providing the best yields and stabilising the enzyme. Several phosphorylated substrates were rationally designed and synthesised; catechyl monophosphate provided the highest intensities at appropriate potentials. Calibration curves for MC-LR and MC-RR were performed, the limits of detection (LODs) being 10-20 µg/L. Real samples of cyanobacteria were analysed and results were correlated with the colorimetric PP2A inhibition assay and high performance liquid chromatography (HPLC) with UV detection. The second strategy was HPLC with fluorescence detection. Three derivatisation protocols were tested, none of them providing successful and/or stable fluorescent MC conjugates. The last strategy was capillary zone electrophoresis with UV detection. This technique separated and detected three MC variants within 4 min, with LODs of 2. 13, 2. 48, and 2. 82 µg/L for MC-LR, MC-YR and MC-YA, respectively. Micellar electrokinetic chromatography separated MC-YA from impurities. MC variants were separated within 12 min, with LODs of 2. 83, 3. 74 and 2. 91 µg/L for MC-LR, MC-YR and MC-YA, respectively. These two approaches were also applied to the analysis of environmental samples.

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Informations

  • Détails : 1 vol.(196 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 166-196

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