Caractérisations biochimique et cinétique de la glucosamine-6-phosphate synthase humaine 1

by Céline Richez

Doctoral thesis in Sciences biologiques. Biochimie

Sous la direction de Marie-Ange Badet-Denisot.


  • Résumé

    La Glucosamine-6-phosphate synthase ou L-glutamine:D-fructose-6-phosphate amidotransférase humaine 1 (Gfat1) est une cible thérapeutique dans les complications pathologiques liées au diabète de type 2. Elle catalyse la première étape de la voie de biosynthèse des hexosamines dont le produit final est l’UDP-N-acétyl-Glucosamine. La protéine contient une étiquette histidine en position interne de sa séquence et est exprimée dans les cellules d’insectes Sf9. Deux tests au format microplaque ont été mis au point pour doser la D-glucosamine-6-phosphate et le L-glutamate pour déterminer les caractéristiques biochimique et cinétique de l’enzyme. L’enzyme recombinante possède des constants d’affinité Km Fru-6-P = 0,98 mM et Km Gln = 0,84 mM similaires à celles décrites pour l’enzyme de foie de rat. Le méanisme cinétique de Gfat1 est de type Bi Bi ordonné, déterminé à partir de l’étude d’inhibition par les produits de réaction. Un criblage de la chimiothèque de l’ICSN a permis d’identifier trois composés qui inhibent spécifiquement l’enzyme humaine, nouvelles pistes pour des molécules anti-diabétiques.

  • Alternative Title

    Biochemical and Kinetic Characterizations of human Glucosamine-6-phosphate synthase 1


  • Résumé

    Human L-glutamine: D-fructose-6-phosphate amidotransferase (Gfat1), a recognized target in type 2 diabetes complications, was expressed in Sf9 insect cells with an internal His6-tag and purified to homogenity. This protein catalyses the first step of biosynthesis pathway of hexosamines whose end product is UDP-N-acetyl-Glucosamine. Two different microplate assays quantify D-glucosamine-6-phosphate and L-glutamate were used to analyze the enzyme kinetic properties. The recombinant human L-glutamine: D-fructose-6-phosphate amidotransferase isoform 1 exhibits Michaelis parameters Km Fru-6-P = 0. 98 mM and Km Gln = 0. 84 mM which are similar to the values reported for the same enzyme from liver rat. The kinetic mechanism ordered Bi Bi rapid equilibrium was determined from product inhibition. A screening of data compounds from ICSN allowed discovering three specific inhibitors of human enzyme that provid interesting targets in medicinal chemistry of anti-diabetic compounds.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (156 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p.129-140.

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 0g ORSAY(2007)94
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