Etude de l'interaction de l'hémophore HasAsm avec ses partenaires : l'hème et le récepteur spécifique de membrane externe HasR

par Célia Caillet-Saguy

Thèse de doctorat en Structure, fonction et ingéniérie des protéines

Sous la direction de Muriel Delepierre.

Soutenue en 2007

à Paris 7 .


  • Résumé

    L'hémophore HasA, sécrété dans le milieu extracellulaire par S. Marcescens, est un transporteur d'hème, qui extrait Thème des hémoprotéines de l'hôte et le délivre à un récepteur de membrane externe spécifique HasR. Le fer de Thème de holoHasA est ferrique et présente une coordination originale histidine 32/tyrosine 75. Un troisième résidu du site de fixation de Thème, H83, forme une liaison hydrogène forte avec Y75, augmentant son caractère tyrosinate et stabilisant la coordination fer-Y75. Les holoprotéines sauvage et mutées au niveau de ces trois résidus ont été caractérisées par spectroscopies UV, RMN, rR et RPE. Les noyaux du squelette et les Cb de holoHasA ont été attribués au moyen d'expériences RMN 15N et 13C en détection directe. Des résonances des ligands axiaux ont été détectées. Nous avons montré que HasA présente un équilibre thermique haut spin/bas spin associé à la modulation de la force de la liaison de coordination fer de Thème-ligand axial Y75, elle-même modulée par la force de la liaison hydrogène Y75-H83. Chez le mutant Y75A, H83 devient un ligand alternatif. Chez le mutant H83A, on observe une série d'équilibres dépendant du pH entre des espèces de coordination variable et pour lesquelles Y75 n'est plus ligand. L'espèce pentacoordonnée détectée à pH physiologique, avec H32 pour unique ligand, pourrait représenter un intermédiaire possible du mécanisme de transfert de Thème au récepteur HasR. Le processus de transfert de Thème de HasA à HasR a été étudié par des expériences RMN HSQC TROSY CRINEPT sur les complexes apoHasA-HasR et holoHasA-HasR en micelles de détergent et a permis d'identifier les régions de HasA impliquées dans l'interaction.

  • Titre traduit

    Study of the interaction of hemophore HasASM with its partners : the heme and the specific outer membrane receptor HasR


  • Résumé

    The extracellular hemophore HasA from S. Marcescens is a heme carrier protein that extracts heme from host hemoproteins and shuttles it to a specific outer membrane receptor HasR. In HasA, heme iron is ferric and has an original coordination with a Histidine 32/Tyrosine 75 axial ligands pair. A third residue of the binding pocket, H83, forms a tight hydrogen bond with Y75, increasing the tyrosinate character of Y75 and stabilizing the Y75-heme iron coordination. Wild-type and mutated holoproteins, H32A, Y75A and H83A, were characterized by UV, NMR, rR and EPR spectroscopies. Using 13C/15N-direct detection NMR experiments, optimized for paramagnetic proteins, it has been possible to assign backbone nuclei and Cb of holoHasA. Resonances of the axial ligands have been detected by 1D NMR experiments. We have shown that HasA presents a thermal high spin/low spin equilibrium related to the modulation of the strength of the heme iron-Y75 axial ligand coordination bond which is modulated by the Y75-H83 H-bond. In the Y75A mutant, H83 becomes an alternatif ligand. In the H83A mutant, removal of H83 causes detachment of the Y75 ligand, thus giving rise to a series of pH dependent equilibria among species with different axial ligation. The five coordinated species detected at physiological pH, with H32 as axial ligand, may represent a possible intermediate of the heme transfer mechanism to the membrane receptor HasR. The heme release process from HasA to HasR were investigated by CRINEPT-TROSY HSQC NMR experiments on apoHasA-HasR and holoHasA-HasR complexes in DPC micelles allowing the mapping of the regions of HasA involved in the HasA-HasR interaction

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Informations

  • Détails : 1 vol. (234 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 275 réf.

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  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2007) 185
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