Ciblage de gène et thérapie génique

par Gwendoline de Piedoue

Thèse de doctorat en Thérapeutiques biotechnologiques

Sous la direction de Jean-Paul Feugeas.

Soutenue en 2007

à Paris 7 .


  • Résumé

    Le ciblage de gène permet de remplacer la séquence mutée d'un gène par sa séquence normale mais l'efficacité du ciblage de gène est actuellement trop faible pour une application thérapeutique. Nous avons développé un système de linéarisation intracellulaire d'un ADN correcteur à partir de plasmides qui augmente d'un facteur 6 à 7 la correction d'ADN extrachromosomique et d'un facteur 3 à 4 le ciblage génomique. De plus, nous avons démontré que la correction déjà améliorée 500 fois par une coupure double brin à proximité de la mutation ciblée par la méganucléase l-Sce I est augmentée d'un facteur 15 par la linéarisation intracellulaire de l'ADN correcteur. D'autres agents endommageant ou clivant l'ADN cible tels que des oligonucléotides formant une triple-hélice et des nucléases chimériques à doigt de zinc ont été testés mais n'ont pas apporté d'effet comparable à celui d'I-Sce I. Nous avons ensuite adapté ce système à des vecteurs lentiviraux déficients pour l'intégration qui transduisent efficacement les cellules primaires telles que les cellules souches hématopoïétiques. Enfin, nous avons évalué l'efficacité d'oligonucléotides simple brin pour cibler une mutation ponctuelle. Nous avons montré que la conjugaison en 5' d'un oligonucléotide 25-mer à une molécule d'acridine augmente le nombre de cellules corrigées de 29 à 65 fois. Ces résultats suggèrent que des intercalants couplés à des oligonucléotides sont capables d'améliorer la correction génique en stabilisant leur interaction avec l'ADN cible. Au total, plusieurs voies sont ouvertes pour atteindre un seuil de correction compatible avec une expérimentation in vivo.

  • Titre traduit

    Towards gene therapy by targeted gene correction


  • Résumé

    Targeted gene correction enables the replacement of the mutated sequence of a gene with its correct séquence but the frequency of gene targeting is too low (10-5) to expect a therapeutic effect. We have developed a System for the intranuclear release of a donor fragment from circular plasmids that improves 6 to 7 fold extrachromosomal gene targeting and 3 to 4 fold a genomic targeted modification. The correction was amplified 500 times by the cleavage of the targeted DNA with the endonuclease l-Sce I and 8000-fold elevated when the targeted DNA double-stranded break was associated with our intracellular linearization System. We have compared innovative DNA cleavage Systems like triple helix-forming oligonucleotides and chimeric zinc-finger nucleases with l-Sce I but we didn't obtain the same effect. We have successfully adapted our intracellular linearization System with non-integrative lentiviral vectors which efficiently transduce primary cells like hematopoietic stem cells. At least we have evaluated the ability of single-stranded oligonucleotides to correct a punctual mutation. The conjugation of an acridine molecule on the 5' end of the oligonucleotide improved the correction 29 or 65 times. To conclude with, a level of correction compatible with an in vivo experimentation is incoming through these ways of investigation.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (160 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 217 réf.

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  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2007) 050
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