Développement de méthodes de production et d'analyse de vecteurs recombinants dérivés de l'adéno-associated virus

par Véronique Blouin

Thèse de doctorat en Médecine. Virologie

Sous la direction de Philippe Moullier.


  • Résumé

    De nombreuses études in vivo ont montré que les vecteurs recombinants dérivés de l'adéno-associated virus (AAVr) peuvent transduire efficacement de nombreux organes et conduisent à une expression stable et à long terme du gène. Ces résultats encourageants ont conduit au développement rapide des essais cliniques utilisant les vecteurs AAVr-2. Cependant ces essais chez l'homme nécessitent de grandes quantités de vecteurs AAVr. Les techniques conventionnelles de production et purification montrent alors leurs limites. Nous avons donc développé des méthodes de productions alternatives plus simples et reproductibles, en établissant des lignées stables, d'encapsidation, contenant intégré dans leur génome les gènes rep-cap hybrides pour les sérotypes-1 et -5. Nous avons aussi décrit une procédure de purification par chromatographie liquide basée sur des résines échangeuses d'ions. Cette procédure a l'avantage d'être directement applicable à grande échelle, et pourrait s'adapter à différents sérotypes. Cette méthode permet de purifier le sérotype-5, le plus divergent au niveau de la séquence protéique de la capside comparée à 1'AAVr-2. Les stocks d'AAVr obtenus présentent une pureté supérieure aux méthodes traditionnelles et transduisent aussi efficacement les organes cibles. Afin de mieux caractériser et différentier les capsides AAVr des différents sérotypes de plus en plus nombreux, nous avons montré que la digestion protéolytique des virions AAVr-2, donne un profil de digestion unique. Cette analyse protéolytique des capsides AAVr permet de distinguer les AAVr-2 des AAV-1 et -5.

  • Titre traduit

    Development of analysis and production methods for adeno-associated virus recombinant vectors


  • Résumé

    Numerous in vivo studies have demonstrated that rAAV vectors can efficiently transduce many tissues and lead to stable gene expression. These encouraging results have led to a rapid development of clinical trials involving the use of rAAV-2 vectors. However, the obtainment of large-scale rAAV-2 vector stocks for clinical assay is still hampered by the conventional production methods that are not efficient and difficult to scale-up. We develop a simple and reproducible alternative method based on stable packaging hybrid cell lines containing integrated into their genome the rep-cap genes of serotypes -1 and -5. Another critical step for the assessment of these vectors in clinical trials is the method used for purification of rAAV particles. We developed a purification method, which comprises two-step chromatography process based on the use of ion- exchange resins. This process can be easily scaled up and could be applied to different AAV serotypes. We purified the serotype-5, the most divergent in terms of capsid composition compared to AAV-2. The rAAV stocks obtained are pure and transduced efficiently target tissues. To characterize rAAV capsid from different serotype, we have shown that proteolytic digestion of rAAV virions is able to generate a characteristic cleavage pattern that can be use to distinguish AAV-2 from AAV-1 and -5.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (169-[30] f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 147-168 f. [361 réf.]

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université de Nantes. Service commun de la documentation. BU Santé.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 07 NANT 13-VS
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