Caractérisation cristallographique d'intermédiaires réactionnels de méthionine sulfoxyde réductases en vue de la compréhension de leur mécanisme catalytique : Les trois domaines de la protéine multifonctionnelle PilB de Neisseria meningitidis et la MsrB de Xanthomonas campestris

par Fanomezana Moutsé Ranaivoson

Thèse de doctorat en Enzymologie moléculaire et Biologie structurale

Sous la direction de André Aubry et de Frédérique Favier.

Soutenue en 2007

à Nancy 1 .


  • Résumé

    Les résidus méthionine sont facilement oxydables en sulfoxydes in vivo. Cette oxydation est réversible via la méthionine sulfoxyde réductase (Msr), un enzyme ubiquitaire. Dû aux deux configurations possibles du sulfoxyde, deux classes d'enzyme structuralement différents existent : les MsrA sont spécifiques de l'isomère S, et les MsrB de l'isomère R. Les deux possèdent un même mécanisme catalytique en deux étapes. La première étape est dédiée à la réduction du substrat ; elle aboutit à l’oxydation d’une cystéine en acide sulfénique. Puis le recyclage de l’enzyme s’opère avec la formation d’un pont disulfure intramoléculaire qui est finalement réduit par une thiorédoxine (Trx). Chez Neisseria meningitidis la protéine PilB porte MsrA et MsrB sous forme de deux domaines. Un troisième domaine à activité du type Trx existe en N-terminal. Les trois domaines isolés ont été étudiés par cristallographie. (i) Le domaine N-terminal : la structure confirme son homologie avec la Trx, mais son analyse révèle des éléments probablement à l’origine d’un fonctionnement particulier. (ii) La MsrA : la structure de deux mutants a permis d’observer un complexe avec un substrat et l’acide sulfénique. Leurs études s’additionnent à celles de l’enzyme sauvage sous formes réduite et oxydée. (iii) La MsrB : la structure d’un mutant a également permis d’obtenir un complexe et complète les structures des formes réduite et oxydée du sauvage. En addition, la structure de la MsrB de Xanthomonas campestris met à jour des différences conformationnelles entre MsrB d’organismes différents. Enfin, l’étude structurale de PilB entier a été entamée en solution par la méthode de diffusion aux petits angles.

  • Titre traduit

    Crystallographic characterisation of reactional intermediates of methionine sulfoxide reductases with the aim of understanding their catalytic mechanism : The three domains of the multifunctional protein PilB from Neisseria meningitidis and the MsrB from Xanthomonas campestris


  • Résumé

    Methionine residues are easily oxidized to sulfoxides, in vivo. This oxidation is reversed via a ubiquitous enzyme named methionine sulfoxide reductase (Msr). Due to the two possible configurations of the sulfoxide group, two structurally-different classes of enzymes exist: MsrAs are specific for the isomer S, and MsrBs for the isomer R. Both classes act through a two-step mechanism. The first step is dedicated to substrate reduction. It results in the sulfenic form of the catalytic cysteine. Then recycling of the enzyme starts with the formation of an intramolecular disulfide bridge, finally reduced by thioredoxin (Trx). In Neisseria meningitidis, the protein PilB bears MsrA and MsrB as two adjacent domains. A third domain with a Trx-like activity exists at the N-terminal end. The three isolated domains have been studied by X-Ray crystallography. (i) The N-terminal domain: its structure confirmed its homology to Trx and DsbEs, but its analysis revealed elements that probably explain its peculiar properties. (ii) MsrA: the structures of two mutants allowed the observation of a complex with the substrate and of the sulfenic acid. These results add to the structure of the reduced and oxidized forms of the wild type domain so that the catalytic mechanism can be analyzed. (iii) MsrB: the structures of the reduced and oxidized forms were completed by that of a complex with the substrate obtained from a mutant. In addition, comparison with the Xanthomonas campestris MsrB structure enlightened conformational differences between MsrBs from distinct organisms. Finally, structural studies of the whole PilB protein have been initiated in solution using small angle X-Ray scattering.

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  • Annexes : Bibliogr.

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