Rôle des modifications post-traductionnelles des aquaporines de la racine d’Arabidopsis thaliana dans la regulation du transport d’eau

par Sodana Prak

Thèse de doctorat en Biologie des organismes

Sous la direction de Véronique Santoni et de Christophe Maurel.

Soutenue en 2007

à Montpellier 2 .


  • Résumé

    Les aquaporines (AQP) sont des canaux facilitant le passage de l'eau au travers des membranes biologiques et, chez les plantes, elles contribuent de façon majeure au transport de l'eau dans la racine. Le maintient de l'équilibre hydrique des plantes dépend en grande partie de la régulation des AQP, notamment en réponse à des contraintes environnementales tel que le stress salin. L'objectif de cette thèse a été d'évaluer le rôle des modifications post-traductionnelles (MPT) portées par les AQP de la membrane plasmique (MP) ou Plasma Intrinsic Protein (PIP) de la racine d'Arabidopsis sur la régulation de leur fonction en couplant des approches protéomiques et fonctionnelles. L'approche protéomique basée sur la purification des AQP par SDS-PAGE couplée à la spectrométrie de masse a été optimisée quant aux processus de digestion et de détection des MPT. Cette étude a montré que 9 isoformes PIP sont exprimées dans la MP de la racine d'Arabidopsis et que certaines d'entre elles sont méthylées sur des résidus lysine et glutamate de l'extrémité N-terminale. Ce type de MPT est originale chez les AQP et pour les protéines membranaires en général. La signification fonctionnelle de la méthylation a été évaluée in vitro par spectrophotométrie en flux interrompu en mesurant la perméabilité hydrique osmotique (Pf) de vésicules de MP traitées par la S-adénosyl méthionine (SAM), le donneur universel de méthyle dans les réactions enzymatiques de méthylation. Bien que la Pf de la MP soit clairement diminuée par l'addition de SAM, la cible méthylée n'a pas encore été identifiée. Par ailleurs, l'enrichissement en phosphopeptides par des colonnes IMAC et TiO2 a permis d'identifier de multiples sites de phosphorylation au niveau de l'extrémité C-terminale des isoformes PIP2;1, PIP2;2, PIP2;4 et PIP2;7. Il a été précédemment montré que le traitement des plantes par 100 mM NaCl induit à court terme (< 2 h) une baisse de 70 % de la perméabilité hydrique de la racine mesurée in vivo. De façon similaire, la Pf de la MP purifiée de racines de plantes traitées est diminuée de 45 % et 60 % après, respectivement, 2 et 4 h de traitement. A court terme, aucune modulation du profil des MPT ne peut expliquer cette inhibition de l'activité des AQP. Néanmoins, par une approche de protéomique semi quantitative, il a été démontré que cette inhibition est associée, à partir de 4 h de traitement salin, à une baisse du niveau de phosphorylation de la Ser283 de l'AQP majeure de la racine PIP2;1. La signification fonctionnelle des deux sites C-terminaux de phosphorylation de PIP2;1 a été approfondie par l'étude en microscopie confocale de la localisation subcellulaire de protéines mutées sur ces sites et fusionnées à la GFP. Ainsi, il a été démontré que la phosphorylation de la Ser283 est nécessaire à l'adressage correct de PIP2;1 à la MP. De plus, cette phosphorylation est également impliquée dans la relocalisation de la protéine dans des structures intracellulaires sphériques en réponse à un traitement salin. Au final, ces travaux ont permis de mettre en évidence l'implication de MPT dans des mécanismes variés de régulation de la fonction des AQP

  • Titre traduit

    Water transport regulation by aquaporin post-translational modifications in the root of Arabidopsis


  • Résumé

    Aquaporins (AQPs) are channels facilitating the water transport through biological membranes and, in the plants, their contribution to the root water transport is major. The plant water status depends mainly on the regulation of AQP function, in particular in response to environmental constraints such as saline stress. The aim of this thesis was to evaluate the role of post-translational modifications (PTM) carried the plasma membrane (PM) AQPs or Plasma Intrinsic Proteins (PIPs) in the root of Arabidopsis on the regulation of their function by coupling proteomic and functional approaches. The proteomic approach based on the purification of AQPs by SDS-PAGE coupled with mass spectrometry was optimized for the processes of digestion and detection of PTMs. This study showed that 9 PIP isoforms are expressed in Arabidopsis root PM and that some of them are methylated on lysine and glutamate residues on the N-terminal domain of the proteins. This type of PTM is original for AQPs and for membrane proteins in general. The functional significance of the methylation was evaluated in vitro by stopped-flow spectrophotometry by measuring the osmotic water permeability (Pf) of PM vesicles treated by S-adenosyl methionine (SAM), the universal methyl donor in the enzymatic reactions of methylation. Although the Pf of the PM is clearly decreased by the addition of SAM, the methylated target was not identified yet. In addition, phosphopeptides enrichment by IMAC and TiO2 columns made it possible to identify multiple phosphorylation sites on the the C-terminal domain of PIP2;1, PIP2;2, PIP2;4 and PIP2;7. It was previously shown that the treatment of plants by 100 mM NaCl induced, in short term (< 2 H), a 70 % decrease of root water permeability measured in vivo. In a similar way, the Pf of root PM of treated plants is decreased, respectively, by 45 % and 60 % after 2 and 4 h treatment. In short term, no modulation of PTMs profile can explain this inhibition of AQP activity. Nevertheless, by a semi quantitative proteomic approach, it was shown that this inhibition is associated, after 4 h of salt treatment, with a decrease of Ser283 phosphorylation level of the root major AQP PIP2;1. Functional significance of the two C-terminal sites of phosphorylation of PIP2;1 was studied by confocal microscopy for the subcellular localization of mutated proteins on these sites and fused to GFP. Thus, it was shown that the phosphorylation of Ser283 is necessary to the correct targeting of PIP2;1 to PM. Moreover, this phosphorylation is also involved in the PIP2;1 relocalization in spherical intracellular structures in response to a salt treatment. In conclusion, this work made it possible to highlight the implication of PTMs in varied mechanisms of regulation of AQP function

Consulter en bibliothèque

La version de soutenance existe sous forme papier

Informations

  • Détails : 1 vol. (99 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 88-99

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TS 2007.MON-30
Voir dans le Sudoc, catalogue collectif des bibliothèques de l'enseignement supérieur et de la recherche.