Identification de séquences Cis-Régulatrices impliquées dans l'activité de l'origine de réplication de l'ADN de la Lamine B2

par Matthieu Cubells

Thèse de doctorat en Biochimie et biologie moléculaire

Sous la direction de Silvano Riva et de Gérard Roizès.

Soutenue en 2007

à Montpellier 2 en cotutelle avec l'Università degli studi (Pavie, Italie) .


  • Résumé

    Les éléments agissants en cis nécessaires à l’activité des origines de réplication de l’ADN chez les métazoaires sont peu connus. Nous avons étudié le rôle des ces éléments sur l’activation de l’origine de réplication humaine associée au gène de la Lamine B2 (LaminB2-Ori). Nous avons généré des clones de cellules HeLa à partir de l’intégration stable d’un fragment d’ADN de 1. 2 kb, contenant le site d’initiation de la réplication et un îlot CpG. Nous avons étudié l’initiation de la réplication par PCR sur les ADN naissants provenant de cellules asynchrones. Dans la majorité des clones, l’activité de cette origine ectopique était comparable à celle de l’origine endogène. Dans quelques cas, ce fragment montrait une activité réplicative réduite. Pour réduire la variabilité de l’activité due à l’environnement chromatinien du site d’insertion, nous avons développé un outil d’insertion site-spécifique via la recombinase Cre de cassettes contenant la LaminB2-Ori ectopique. Cette méthode présente une homogénéité de l’activité de la LaminB2-Ori ectopique et par conséquent permet de quantifier l’activité de mutants de cette Ori. Une dissection des éléments en cis en proximité de l’origine de la Lamine B2 ectopique a été réalisée. Les résultats indiquent que la séquence centrale de l’origine, où se fixe le complexe ORC, est nécessaire à l’initiation de la réplication et que l’îlot CpG, les sites de fixation des facteurs de transcription et la présence de gènes activement transcrits influencent l’initiation de la réplication. L’ensemble des résultats suggère que la LaminB2-Ori possède une organisation modulaire de séquences en cis. Cette structure peut imposer une configuration chromatinienne spécifique ou favoriser quelques modifications épigénétiques qui promeuvent l’initiation de la réplication et que l’activation de la LaminB2-Ori domine sur les séquences environnantes

  • Titre traduit

    Identification of Cis-regulating sequences involved in the activity of the lamin B2 origin of DNA replication


  • Résumé

    The cis-acting elements necessary for the activity of DNA replication origins in metazoan are poorly understood. We studied the role of this elements on the activation of the human origin of replication associated to the Lamin B2 gene. We generated HeLa clones of stable integration of a 1. 2 kb DNA segment, comprising the start site of DNA replication and the CpG island. We assessed the initiation of DNA replication by PCR on nascent DNA isolated from asynchronously cells. In the majority of clones the activity of this ectopic origin was comparable to the endogenous origin. In some cases this segment shows a reduced replication activity. For reducing the variability due to the chromatin environment of the insertion site, we developed a toll of site-specific integration mediated by the Cre recombinase of cassettes containing the ectopic LaminB2-Ori. This method shows homogeneity of activity of the ectopic LaminB2-Ori, and by consequence the possibility to quantify the mutants Ori activity. A dissection of the cis-elements in the closed proximity of the ectopic Lamin B2 origin was carried out. The results indicate that core sequence of the origin which is bound by the ORC complex is required for the initiation of the replication and that the CpG island, binding sites for transcription factors and the presence of actively transcribed genes positively influence the replication initiation. Altogether these results suggest that the LaminB2-Ori shows a modular organization of cis-acting sequences. This structure may impose a specific chromatin configuration or favorite some epigenetic modifications that prompt the initiation of replication and that LamB2-Ori activation is dominant over the surrounding sequences

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Informations

  • Détails : 1 vol. (132 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p.107-117. Annexes

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  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TS 2007.MON-10
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