Caractérisation moléculaire des voies apoptotiques impliquées dans la réponse à un stress hypoxique, dans des lignées de neuroblastome humain, présentant ou non un gène TP53 muté

par Christophe Stenger

Thèse de doctorat en Biologie - Sciences - Santé. Médecine

Sous la direction de Marie-Hélène Ratinaud.

Soutenue en 2007

à Limoges .


  • Résumé

    Le développement de tumeurs solides, dont les neuroblastomes, aboutit à des zones de moindre vascularisation, plus faiblement oxygénées. Dans ces zones hypoxiques, les cellules cancéreuses vont subir un stress ; certaines d'entre elles vont le surmonter et devenir plus résistantes à la chimiothérapie, tandis que d'autres vont induire un processus de mort cellulaire. Les données actuelles indiquent que la voie intrinsèque de mort, ou voie mitochondriale, est recrutée, mais l'implication de p53 n'est pas toujours explicite. C'est pourquoi, nous avons exploré son rôle dans ce processus. A cet effet, nous avons utilisé une molécule mimétique de l’hypoxie (le chlorure de cobalt), pour traiter in vitro deux lignées de neuroblastomes humains, ayant un statut de p53 différent. La lignée SHSY5Y possède un allèle sauvage du gène TP53, tandis que la lignée SKNBE(2c) possédant un allèle muté, code pour une p53 modifiée, transcriptionnellement inactive. Dans la lignée SHSY5Y, la signalisation de mort implique la voie mitochondriale, via une expression précoce de p53, impliquant sa phosphorylation sur la serine 15 et sa localisation mitochondriale. L'expression concomitante de Bax-alpha, dépendante de p53, entraîne un collapse du potentiel membranaire mitochondrial. Plus tardivement, p53 phosphorylée sur la thréonine 81, est présente dans le noyau ; ceci paraissant corrélée avec une accumulation de PUMA et une mort massive. Dans la lignée SKNBE(2c), ni Bax-alpha, ni PUMA ne semblent impliqués dans la signalisation de mort, tandis que l'expression de p53 diminue au cours du stress hypoxique. Toutefois, à l'instar de la lignée SHSY5Y, p53 dans la lignée SKNBE(2c) est phosphorylée sur la thréonine 81, sans que ceci soit reliée à des changements d'expression des protéines étudiées. Afin de préciser le rôle de p53, nous avons éteint dans la lignée SHSY5Y son expression par ARNi, puis nous l'avons traité par le chlorure de cobalt. La signalisation de mort est activée très rapidement, malgré l'absence de p53 et des protéines dont l'expression en dépend (p21, Bax-alpha). En revanche, il se produit un recrutement de molécules intervenant dans la signalisation « des récepteurs de mort », dont l'activation de la caspase-8 et le clivage de Bid qui est transférée à la mitochondrie. Par conséquent, il apparaît que p53 est un des principaux acteurs de la mort cellulaire induite par la molécule mimétique de l'hypoxie, mais que son absence entraîne le recrutement d'une signalisation de mort alternative. Des travaux complémentaires devraient préciser les connexions possibles entre ces deux voies de mort, qui peuvent être intéressantes pour des aspects thérapeutiques. L'utilisation d'une autre molécule mimétique de l'hypoxie, la desferoxamine (DFO) induit également une stabilisation d'HIFl-alpha et une expression de p53. Cependant, la signalisation de mort semble impliquer d'autres mécanismes que ceux activés par le chlorure de cobalt.


  • Résumé

    Neuroblastoma, as many others solid tumor, develops hypoxia areas (lesser vascularization, more weakly oxygenated). In these hypoxia areas, cells are going to undergo a stress; some of them are able of surviving (through metabolism changes) and to become more resistant to the chemotherapy, whereas others induce a cell death. The current data indicate that the intrinsic mitochondrial pathway is recruited, but the involvement of p53 is not still explicit. To investigate its role we used a hypoxia-mimetic agent (cobalt chloride), to treat in vitro two cell lines of human neuroblastoma beings, having a status of p53 different. The SHSY5Y cells possess a wild type TP53 gene, whereas the SKNBE(2c) line carrying a mutated TP53 gene expressed a mutated-DNA-binding domain p53. After analysing CoCl2-induced mitochondrial apoptosis pathway, we characterized p53, Bax-α and PUMA implication in SHSY5Y cell death. Early, p53 was phosphorylated at serine 15 and located onto mitochondria where it triggered a mitochondrial membrane potential collapse. Later, when phosphorylated at threonine 81, p53 translocated in the nucleus, which correlated with PUMA accumulation. In SKNBE(2c) cells, Bax-α and PUMA seemed not to be implicated and p53 exhibited only a threonine 81 phosphorylation pattern. Thus, when p53 is mutated, others pathway might be recruited in order to permeabilize mitochondria and activate caspase-3. In order to study p53 function in CoCl2-induced cell death, we down-regulated p53 expression by RNAi. After transfection and CoCl2 treatments, we observed cell death without p53 expression. As expected, p53 targeted proteins, such as p21 and Bax, were not up-regulated. Nevertheless, a mitochondrial membrane potential collapse and a caspase-3 activation appeared earlier. Thus in transfected cells we showed that, CoCl2-induced cell death, was triggered by caspase-8 activation and tBid mitochondrial translocation, indicating recruitment of cell death receptor pathway regulators. Our results suggest that p53 is the central molecular actor of the apoptotic response in SHSY5Y following a hypoxia-like stress, but that its lack activates an alternative cell death pathway, which constitute potentially new insights in therapeutic approaches.

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  • Détails : 1 vol. (159 f..)
  • Annexes : Bibliogr. f. 132-152

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  • Cote : MFTH 11184
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