Etude de la multiplication de la souche JFH-1 du virus de l'hépatite C (VHC) en cellules Huh-7 : adaptation et sélection de mutations permettant une production rapide et massive du VHC, localisation subcellulaire de protéines du VHC, mise en évidence de clones cellulaires résistants à l'infection par le VHC

par David Delgrange

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire

Sous la direction de Czeslaw Wychowski.

Soutenue en 2007

à Lille 2 .


  • Résumé

    Notre étude sur le virus de l'hépatite C (VHC) de génotype 2a a initialement été entreprise pour pallier le problème lié à la production virale du VHC. Ayant obtenu des titres comparables à ceux publiés, nous avons cherché à développer une approche expérimentale nous permettant de les améliorer. Pour cela, nous avons effectué des infections successives de cellules Huh-7 naïves. Nous avons montré, dans un premier temps, qu'il était possible d'obtenir des cellules Huh-7 chroniquement infectées pendant plusieurs mois. La localisation subcellulaire des protéines structurales, telles que la protéine de la capside et les glycoprotéines E1 et E2, ou de la protéine non structurale NS3 a alors été réexaminée dans le contexte d'un cycle infectieux du VHC. L'analyse de la localisation subcellulaire des protéines structurales du VHC, en immunofluorescence en microscopie confocale, a confirmé que les glycoprotéines E1 et E2 sont maintenues dans le réticulum endoplasmique des cellules infectées. Cependant, et contrairement à d'autres études, ces glycoprotéines ne s'accumulent pas dans les autres compartiments intracellulaires ou à la surface cellulaire. L'association entre la protéine de la capside et les gouttelettes lipidiques a également été confirmée. Cependant, contrairement à certaines études précédentes, la protéine C n'a pas été trouvée dans le noyau de la cellule ou en association avec des mitochondries. De façon surprenante, nous n'avons pas observé de colocalisation entre les hétérodimères E1E2 et la protéine C en cellules infectées. Par ailleurs, nous avons observé une colocalisation partielle entre la protéine de la capside et la protéine NS3, et lorsque les gouttelettes lipidiques sont révélées la protéine NS3 se retrouve autour de ces gouttelettes. Ainsi, la localisation subcellulaire des protéines structurales du VHC a pu être étudiée pour la première fois dans le contexte d'un cycle infectieux. Dans un second temps, nous avons cherché à définir si des changements dans le génome viral du clone JFH-1 pouvaient expliquer l'augmentation des titres infectieux que nous avions obtenu au cours des infections successives des cellules Huh-7. Le séquençage de l'ARN du VHC nous a permis de déterminer qu'une mutation majeure, N534K, était apparue dans la séquence codant la glycoprotéine E2 du virus. De manière intéressante, cette mutation empêche la glycosylation d'un des sites de N-glycosylation présent sur la glycoprotéine E2. En outre, lorsque cette mutation est directement introduite dans la séquence du JFH-1, elle facilite l'infection des cellules Huh-7 naïves. Dans une deuxième approche, et fort de nos résultats obtenus dans une étude portant sur des virus chimériques 1a-2a du VHC, nous avons mis en évidence que la sécrétion des particules virales du VHC de génotype 2a pouvait être améliorée par la substitution de deux acides aminés (F172C et P173S) localisés dans la séquence codant la protéine de la capside du VHC. L'insertion de ces variations (F172C, P173S et N534K) dans le génome du VHC de génotype 2a permet de produire des titres infectieux très conséquents. Ainsi, la substitution de certains acides aminés dans la séquence codant les protéines structurales permet de produire des titres infectieux du VHC importants et indépendemment de la lignée cellulaire Huh-7 utilisée. Lors de l'étude des mutants hautement productifs du clone JFH-1, nous avons observé un phénomène de cytotoxicité important sur la lignée cellulaire Huh-7. Bien que ce phénomène ne soit pas encore expliqué, nous avons été en mesure de sélectionner plusieurs clones cellulaires résistants à cet effet cytopathique. L'analyse de ces clones a montré qu'ils étaient résistants à l'infection par le VHC. Cette résistance est le résultat de la perte d'expression d'un récépteur majeur pour l'infection du VHC, la molécule de surface CD81. L'étude de ces clones cellulaires nous a permis de confirmer le rôle primordial que joue CD81 dans l'infection par le VHC.


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Informations

  • Détails : 1 vol. (193 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 157-184

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  • Bibliothèque : Université du droit et de la santé. Service Commun de la Documentation. BU Santé - Learning center.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 50.379-2007-11-C
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