Développement d’un modèle prédictif de l’énantiosélectivité des lipases

par Sophie Guenot

Thèse de doctorat en Microbiologie et biocatalyse industrielle

Sous la direction de Magali Remaud.

Soutenue en 2007

à Toulouse, INSA .


  • Résumé

    L’étude a porté sur le développement d’un modèle prédictif de l’énantiopréférence de la lipase de Burkholderia cepacia ATCC 21808 et plus particulièrement sur la relation pouvant exister entre l’accessibilité au site actif des énantiomères dérivés du (R,S)-alpha-bromo-phényl acétate d’éthyle et l’énantiosélectivité. Une approche mixte, couplant des techniques de modélisation moléculaire classiques à de nouvelles techniques algorithmiques de planification de mouvements issues de la robotique, a été utilisée pour modéliser les trajectoires de différents esters dérivés de l’alpha-bromo-phényl acétate d’éthyle. Les résultats obtenus in silico ont montré que les recherches de trajectoires sont plus rapides avec l’énantiomère (R) qu’avec l’énantiomère (S) pour 7 substrats synthétisés par voie chimique. De manière qualitative, ces résultats corrèlent avec l’énantiosélectivité de l’enzyme, obtenue expérimentalement, indiquant que celle-ci pourrait être associée à une plus ou moins grande difficulté d’accès. De plus, l’analyse des trajectoires a permis d’identifier des cibles privilégiées de mutagénèse (points de collision fréquemment rencontrés pour tous les substrats) parmi lesquels trois positions ont été retenues : Leu-17, Val-266 et Leu-287. Afin de générer et caractériser ces mutants ponctuels, un système d’expression recombinante de la lipase de B. Cepacia chez E. Coli et un protocole de purification par chromatographie d’affinité ont été développés. Les gènes lip et hp codant respectivement pour la lipase et sa protéine chaperonne ont été clonés dans différents vecteurs d’expression sous le contrôle de différents promoteurs. Le plus haut niveau d’activité lipase sous forme soluble jamais décrit dans la littérature concernant cette enzyme a été obtenu en utilisant le vecteur pFLAG-ATS sous le contrôle du promoteur tac (6679 U/Lculture). Les mutants ponctuels ont été construits par mutagénèse dirigée en remplaçant chaque position par les 19 autres acides aminés possibles. Les mutants V266, présentant les plus hautes activités lipase lors d’un crible au para-nitrophényl butyrate, ont été sélectionnés dans un premier temps afin de mesurer leurs énantiosélectivités lors de l’hydrolyse de l’α-bromo phényl acétate de 2-chloro éthyle. Parmi ces mutants, le V266G, présente une inversion d’énantiosélectivité en faveur de l’énantiomère (S) (E=18). L’absence de chaîne latérale de la glycine diminue l’encombrement stérique au niveau de la position 266 permettant ainsi à l’énantiomère (S) soit d’accéder plus facilement au site catalytique, soit de mieux se positionner pour former l’intermédiaire tétraédrique. En parallèle, un protocole de production de la lipase de B. Cepacia à l’échelle microplaque a été développé et validé sur la banque de mutants V266, afin de disposer, à terme, d’un outil de criblage pour de plus larges banques de mutants créées par évolution dirigée

  • Titre traduit

    Building a predictive model of lipase enantioselectvity


  • Résumé

    The study focused on the development of a predictive model of Burkholderia cepacia ATCC 21808 lipase enantioselectivity and more specifically on the relationship that may exist between enantioselectivity and the accessibility to the active site of (R/S)-alpha-bromo phenyl acetic acid ethyl ester derivatives. A mixed approach, combining molecular modelling techniques and path planning algorithms issued from robotics research, was used to compute the geometrically allowed trajectories of various alpha-bromo phenyl acetic acid ethyl ester derivatives. In silico results indicated that the pathways are computed faster for the (R) enantiomer than the (S) enantiomer for 7 substrates synthesized by chemical synthesis. These results are in qualitative agreement with the enzyme enantioselectivity experimentally determined, indicating that enantioselectivity could be associated with a greater or lesser difficulty of access. In addition, the analysis of trajectories allowed to identify targets for mutagenesis (collision points frequently encountered for all substrates), amongst which three positions were selected: Leu-17, Val-266 and Leu-287. In order to generate and characterize these rational mutants, a recombinant expression system of B. Cepacia lipase in E. Coli and a purification protocol by affinity chromatography have been developed. Genes lip and hp encoding respectively for the lipase and its chaperone protein were cloned in different expression vectors under the control of different promoters. The highest level of lipase activity in soluble form ever described in the literature for this enzyme was obtained by using the vector pFLAG-ATS under the control of the tac promoter (6679 U / Lculture). Rational mutants were constructed by site-directed mutagenesis by replacing each position by the 19 other possible amino acids. Mutants V266, displaying the highest lipase activities in screening with para-nitrophenyl butyrate, were selected to measure their enantioselectivity during hydrolysis of the (R,S)- a-bromo phenyl acetic acid 2-chloro ethyl ester. Among these mutants, V266G displayed an inverted enantioselectivity in favour of the (S)-enantiomer (E=18). The absence of side chain in glycine decreases the steric hindrance at position 266, allowing thus the (S)-enantiomer to (a) access more easily to the catalytic site or (b) adopt a more easily productive conformation in order to form the tetrahedral intermediate. In parallel, a protocol for the production of B. Cepacia lipase at microplate scale has been developed and validated on the library of V266 mutants, in order to dispose of a screening tool for larger mutants libraries created by directed evolution

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Informations

  • Détails : 1 vol. (245 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 201-234

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  • Bibliothèque : Institut national des sciences appliquées. Bibliothèque centrale.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2007/921/GUE
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