Etudes structurales, cellulaires et pharmacologiques de la synthèse des galactolipides chez arabidopsis thaliana et toxoplasma gondii

par Cyrille Botté

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de Eric Maréchal et de Corinne Mercier.

Soutenue en 2007

à l'Université Joseph Fourier (Grenoble) .


  • Résumé

    Les galactoglycérolipides (i. E. Monogalactosyldiacylglycérol, MGDG et digalactosyldiacylglycérol, DGDG) sont les lipides majeurs des membranes des chloroplastes, représentant jusqu'à 80% de la composition membranaire plastidiale. La synthèse de ces galactolipides est catalysée par deux types de galactosyltransférases, les MGDG synthases (ou MGD) et les DGDG synthases (ou DGD), Lors de cette synthèse, un groupement [ Beta]-galactosyl provenant d'un UDP-[alpha]Gal, est transféré sur la position sn-3 d'un diacylglycérol (DAG), Les DGD utilisent le MGDG produit par les MGD comme substrat pour la synthèse du DGDG, La synthèse du MGDG est donc essentielle pour la biogenèse du chloroplaste et par conséquent pour la survie de la cellule végétale. Les Apicomplexes sont des parasites intracellulaires obligatoires d'importance médicale et vétérinaire. Ils possèdent un plaste vestigial non-photosynthétique, nommé apicoplaste, acquis par endosymbiose secondaire d'une algue rouge. L'apicoplaste est impliqué dans de nombreuses voies métaboliques de type végétal. De plus, il est essentiel à la survie du parasite, La synthèse de galactolipides aux propriétés chromatographiques indiscernables de celles du MGDG et du DGDG a été mesurée chez Toxoplasma gondii, le parasite Apicomplexe responsable de la toxoplasmose. Nous avons entrepris une étude comparative du métabolisme et de la dynamique des galactolipides chez les plantes et des lipides structurellement apparenté chez les parasites Apicomplexes, par des analyses de biochimie, biologie structurale, moléculaire et cellulaire chez A. Thaliana et T gondii. Nous avons tout d'abord établi un modèle structural de la MGDG synthase chloroplastique basée sur son homologie avec la glycosyltransférase bactérienne MURG, Ce modèle structural a été validé par mutations ponctuelles rationalisées, Ce modèle indique les résidus impliqués dans la liaison de l'UDP-Gal et permet d'avancer dans notre compréhension du mécanisme catalytique, Il permet de proposer certaines régions comme participant à la fixation du DAG et à l'association à la membrane du chloroplaste, La structure présentée dans ce manuscrit constitue un outil pour l'étude d'inhibiteurs de la MGDG synthase et la compréhension de l'évolution complexe des enzymes de galactosylation. Nous avons montré que des inhibiteurs des MGDG synthases de plantes, identifiés par criblage pharmacologique d'une chimiothèque de 23360 composés, avaient des propriétés herbicides, algicides et antiparasitaire sur A. Thaliana, C. Reinhartdii et T gondii respectivement. Nous avons par la suite engagé un programme d'optimisation par synthèse chimique et mesuré les effets de plus de 200 dérivés des molécules initiales, Cette stratégie nous a permis d'optimiser certaines de ces molécules dans l'objectif de développer des candidats herbicides/médicaments,Grâce à l'utilisation de serums de lapin et de rat obtenus après immunisation avec du DGDG, nous avons détecté chez T gondii un lipide, désigné DGLE (digalactolipid-like epitope), structuralement apparenté au digalactolipide. Ce lipide est localisé au niveau des membranes de la pellicule du parasite. De plus, la localisation du DGLE dépend du stade de vie du parasite, redistribué lors de l'invasion dans une cellule hôte. Le DG LE semble lié aux protéines associées au cytosquelette d'actine et/ou à des domaines membranaires, La détermination du lipidome de la pellicule par spectrométrie de masse montre que des dihexosyl-lipides mineurs dérivés de diacylglycérol, alkyl-acyl ou de céramide ont une masse compatible avec le DGLE, La question de la structure du DGLE, pour sa partie hydrophobe, reste donc irrésolue. Ce lipide a été détecté chez d'autres Apicomplexes tels que Plasmodium falciparum (agent de la malaria) et Cryptosporidium parvum (agent de la cryptosporidiose). Le fait d'avoir pu induire une réponse immunitaire par injection du DGDG chez le lapin et le rat conduisant à la détection d'un épitope à la surface de T gondii, nous a amené à étudier l'antigène digalactolipidique et ses applications éventuelles dans des visées diagnostiques et / ou thérapeutiques. Nous avons montré que le serum provoquaitl'agglutination du parasite et empêchait son invasion dans la cellule hôte in vitro, Le marquage de la surface du parasite par le serum (i. E, l'opsonisation) active la réponse immunitaire inné in vitro. La phagocytose par les macrophages et l'activation du complément est accrue par rapport au contrôle. Ces résultats préliminaires suggèrent que des outils diagnostics et/ou des stratégies vaccinales nouveaux, basés sur la reconnaissance de l'antigène digalactolipidique de surface des parasites Apicomplexes, pourraient être envisagés,Les perspectives de ces travaux incluent une poursuite du développement des inhibiteurs des MGDG synthases pour d'une part des recherches fondamentales par des approches de génétique chimique (invalidation chimique, utilisation de dérivés couplés à la biotine), et d'autre part des applications éventuelles en tant que candidat herbicides et / ou antiparasitaires, L'étude du rôle et de la synthèse des galactolipides chez T gondii nécessitera la résolution de la structure du DGLE et la recherche des enzymes impliquées dans sa synthèse. Les effets remarquables du serum antiDGDG mesuré in vitro devront être approfondis sur modèle animal.


  • Résumé

    Galactolipids (i. E MGDG and DGDG) constitute the major class of lipids within the chloroplast membranes, which can contain up to 80% galactolipids. Galactolipids biosynthesis is held by two galactosyltransferases families in photosynthetic organisms: MGDG synthases (MGDs) and DGDG synthases (DGDs). During the first step of galactolipids synthesis, MGDs catalyze the transfer of a [Beta)-galactosyl moiety from a UDP-[alpha]Gal onto the position sn-3 of a diacylglycerol (DAG). DGDs use the pre-formed MGDG as substrates for DGDG synthesis. MGDG synthesis is thus critical for chloroplast biogenesis and therefore for the photosynthetic cell survival. Apicomplexa are obligatory intracellular parasites responsible for numerous severe animal and human affections such as malaria and toxoplasmosis for instance. They harbor a vestigial non-photosynthetic plastid called the apicoplast originally acquired by secondary endosymbiosis from a red algae. The apicoplast is responsible for several plant-related metabolic pathways. Moreover, it is essential for the parasite survival. Synthesis of galactolipids, with identical chromatographic properties as MGDG and DGDG, has been measured in Toxoplasma gondii, parasite responsible for toxoplasmosis. We started to investigate the similarities between plant and apicomplexan parasite metabolism and dynamics of galactolipids, using biochemistry, structural, molecular and cellular biology approaches in A. Thaliana and T gondii. We first establish a structural model of the chloroplastic MGDG synthase based on tis homology with the bacterial glycosyltransferase MurG. This model was validated by rationnalised site-directed mutagenesis. The model gives indications on residues allowing UDP-Gal fixation and help understand the catalytic mechanisms. This model suggests that sorne residues might be involved in DAG binding and membrane(s) association. The structural model we present in this manuscript constitutes a strong tool for inhibitors identification as weIl as to understand the complex evolution of galactosylation enzymes. Using a High- Throughput Screening approach of a 23360 compounds chemolibrary, we identified 2 inhibitors of the plant MGD in vitro and we showed that these inhibitors are herbicide, algaecide and anti-parasitic against A. Thaliana, C. Reinhardtii and T gondii respectively. We then sarted to optimise these inhibitors by chemical synthesis of more than 200 derivatives from the original molecules and measure their effects on our biological models. This strategy allowed us to characterise sorne molecules for a druglherbicide design development. Using polyclonal rabbit serum raised against chloroplastic DGDG, we detected a lipid, called DGLE (digalactolipid-like epitope), structurally related to digalactolipid in T gondii. This is localized at the parasite pellicle membranes. Its distribution is function of the parasite life stage: it is relocalised during the the process of host cell invasion. DGLE seems associated with actin filaments from cytoskeleton and/or membranes domains. Lipidomic analysis performed by ESI/mass spectometry showed that minor dihexosyl-lipids derived from diacylglycerol, alkylacyl or ceramid have a masss that is compatible with DGLE one. However, structural details conceming the hydrophobic part of DGLE remain unclear. We were able to detect this lipid in other apicomplexan parasites such as Plasmodium falciparum (malaria parasite) and Cryptosporidium parvum (cryptosporidiosis agent). Our work showed that DGDG injection induces an immune response in rats and rabbits and that antibodies issued from this immune response react against a surface antigen in T gondii, led us to study this digalactolipidic antigen and its possible applications in diagnostic and/or therapeutical development. We showed that serum anti-DGDG can induce parasites immunoagglutination and can prevent its invasion into hosts cells in vitro. Opsonisation of parasites by the serum is able to activate innate immune system in vitro. Serum can also increase macrophages phagocytosis and activate the classical pathway of the complement in regard to negative controls. These preliminary results suggest that new diagnostic and therapeutical strategies based on digalactolpid recognition on surface of the parasite could be developed. Perspectives of this work include development of MGDG synthase inhibitors for chemical knockout approaches and as potent candidates for herbicide and/or anti-parasitic development. Study of role and synthesis of galactolipids in T gondii will require solving the precise structure(s) of DGLE. Remarquable effects of anti-DGDG serum observed in vitro will need to be confirmed on animal models.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (229 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 214 à 229

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  • Bibliothèque : Service interétablissements de Documentation (Saint-Martin d'Hères, Isère). Bibliothèque universitaire de Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TS07/GRE1/0264/D
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  • Cote : TS07/GRE1/0264
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