Apport du couplage de l’électrophorèse capillaire à la spectrométrie de masse pour l’étude de complexes protéines : oligosaccharides

par Soraya Fermas

Thèse de doctorat en Chimie analytique

Sous la direction de Florence Gonnet.

Soutenue en 2007

à Evry-Val d'Essonne .


  • Résumé

    L’intérêt croissant pour les glucides bioactifs et leurs complexes avec des protéines requiert une méthodologie adaptée à leur caractérisation. L’électrophorèse capillaire (CE) présente de nombreux avantages pour l’étude d’interactions non covalentes de molécules libres en solution, permettant notamment la détermination de constantes de dissociations. La spectrométrie de masse par ionisation electrospray (ESIMS) est reconnue comme étant une méthode de choix pour l’analyse d’interactions non covalentes mais également de protéines et d’oligosaccharides sulfatés. Nous avons donc mis en œuvre des stratégies de couplage CE-ESIMS appliquées à l’étude de complexes non covalents protéine /oligosaccharide. La validité de ce couplage a d’abord été évaluée par l’analyse du complexe modèle antithrombine / héparine. En fonction des objectifs recherchés, il a été possible soit de maintenir ce complexe non covalent soit de le dissocier en source grâce à des conditions dénaturantes ou non. Le maintien du complexe permet une détermination de sa stœchiométrie, tandis que sa dissociation ouvre la voie de l’identification des ligands. La seconde stratégie a concerné la caractérisation de complexe chimiokines / oligosaccharides. L’étude des complexes non covalents nous a permis d’évaluer les effets de la liaison d’oligosaccharides sur la formation d’oligomères protéiques.

  • Titre traduit

    Contribution of CE-MS hyphenation for the study of protein / oligosaccharide complexes


  • Résumé

    The increasing interest in protein / carbohydrate interaction is accompanied by a demand for viable and high throughput methodologies for their characterization. Capillary electrophoresis (CE) offers powerful attributes for the study of non covalent complexes, particularly as regard the determination of binding parameters. Electrospray mass spectrometry (ESIMS) is widely recognized as a powerful analytical method for the characterisation of sulfated oligosaccharides and non covalent interactions. Therefore, we present data on the implementation of analytical strategies based on CE-ESIMS for the characterisation of protein / carbohydrate complexes. The CE-ESIMS methodology was first applied to the analysis of the prototypic complex between antithrombin and heparin. Ionisation conditions were optimised either to preserve the non covalent complex in the MS source, or allow its dissociation using denaturing conditions. In one hand, the stoichiometry of the complex could be obtained through the MS analysis of the native complex in non-denaturing conditions. In the other hand, the structural characterisation of the sulfated ligand could be performed through dissociation of the complex. This CE-ESIMS approach was also used to investigate on the non covalent complexes formation between the chemokines and oligosaccharides. The isolation of the non covalent complex allowed studying the binding effect on the oligomerisation status of these proteins.

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  • Détails : 1 vol. (IV-189)
  • Annexes : Bibliogr. p. (167-182)

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