Etudes métabolique, pharmacocinétique et cytotoxique de l'haplamine

• Auteur / Autrice : Sompheary Ea
• Direction : Hot Bun
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacologie
• Date : Soutenance en 2007
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 2
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Modélisation pharmacocinétique-pharmacodynamie. Applications en hépatologie et en oncologie (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université d'Aix-Marseille II. Faculté de pharmacie (1970-2011)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spectrométrie de masse

Chromatographie en phase liquide

Toxicologie cellulaire

Pharmacocinétique

Anticancéreux

Résumé

L’haplamine est un alcaloïde de la famille des pyranoquinolines isolé à partir d’Haplophyllum perforatum. Cette substance outre des propriétés oestrogéniques, sédatives et analgésiques semble posséder une activité cytotoxique sur certaines lignées cancéreuses. La mise au point de méthodes originales mettant en oeuvre la chromatographie liquide haute performance (CLHP) et le couplage chromatographie gazeuse-spectrométrie de masse (CPG-SM) nous a permis d’approfondir certains aspects de la pharmacocinétique de cette molécule. Des études in vitro après incubation avec des microsomes hépatiques ont mis en évidence des variabilités inter-individuelles, inter-espèces et inter-sexes, importantes, du métabolisme. Des profils de biotransformation similaires avec la présence de cinq métabolites de phase I : M1, M2, M3, M4 et M6 sont observés chez l’homme, le cobaye et le lapin. Ces différents métabolites ont été identifiés par CPG-SM après silylation comme étant, respectivement, la trans (M1) et cis (M2) -3,4-dihydroxy-9-Odésméthylhaplamine, la trans (M3) et la cis (M4) -3,4-dihydroxyhaplamine et la 9-Odésméthylhaplamine (M6). Grâce à la synthèse des métabolites M3 et M4 et à la mise au point d’une technique CLHP plus sensible et plus spécifique, nous avons pu effectuer les premières études cinétiques in vivo en quantifiant à la fois le produit parent et ses métabolites majeurs. Un travail chez le rat après injection i. P. D’une dose de 40 mg/kg dans le mélange propylène glycol/éthanol/eau a permis de déterminer certains paramètres pharmacocinétiques comme la clairance totale (CLtot), le temps de séjour moyen dans l’organisme (MRT) et le volume de distribution à l’équilibre (Vdss). Des tests in vivo ont, également, été effectués chez le cobaye. Pour les deux espèces étudiées, les métabolites trouvés in vitro s’observent in vivo. Une identification de certains systèmes enzymatiques responsables des biotransformations de l’haplamine a été réalisée. Cette étude a été conduite en utilisant des inhibiteurs spécifiques des principales monooxygénases à CYP450 et certains cytochromes recombinants. Il a été, ainsi, possible de montrer que les isoformes CYP2A6 et 3A4 interviennent, respectivement, dans la réaction de O-désméthylation (M6) et la formation des isomères trans et cis de la 3,4-dihydroxyhaplamine (M3 et M4). Des essais de cytotoxicité, sur différentes lignées cancéreuses humaines (coliques : HT29, LS174T, SW620 ; pancréatiques : Capan-1, Capan-2 et hépatiques : HepG2), ont été réalisés avec l’haplamine et ses métabolites M3 et M4. Les produits de biotransformation ne montrent aucune propriété cytotoxique, par contre, l’haplamine révèle une certaine efficacité sur la lignée pancréatique Capan-2. Cette observation est confirmée par une étude de la mort cellulaire qui montre une induction importante de l’apoptose précoce/tardive et de la nécrose par l’haplamine.

Haplamine is an alkaloid of pyranoquinolin family isolated from Haplophyllum perforatum. This compound has estrogenic, sedative and analgesic properties and cytotoxic activity on certain cancer lines. The high performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography-mass spectrometry (CPG-SM) were used for the pharmacokinetic studies of this substance. In vitro studies, after incubation with the hepatic microsomes, showed the important inter-individuals, inter-species, and inter-sexes variability of haplamine metabolism. 5 phase I metabolites : M1, M2, M3, M4, and M6 in human, guinea-pig and rabbit were found. These metabolites were identified by CPG-SM after silylation as trans (M1) and cis (M2) -3,4-dihydroxy-9-O-desmethylhaplamine, trans (M3) and cis (M4) -3,4- dihydroxyhaplamine, and 9-O-desmethylhaplamine (M6), respectively. M3 and M4 synthesis and HPLC method validation, which is more sensible and specific, are important to realise these first kinetic in vivo studies by quantification of the parent drug and its major metabolites at the same time. After 40 mg/kg i. P. Injection in propylene glycol/ethanol/water mixture into the rat, several pharmacokinetic parameters as total clearance (CLtot), mean residence time (MRT) and distributionvolume at the steady-state (Vdss) were estimated. In vivo studies were performed also with the guinea-pig. For these two species studies, the metabolites found in vitro were observed in vivo. Identification of certain enzymatic systems responsible for haplamine biotransformation was realised. Specific inhibitors of principal CYP450 monooxygenases and certain recombinant cytochromes were studied. It is possible to demonstrate that CYP2A6 and CYP3A4 isoenzymes participated, respectively, in Odesmethylation (M6) and isomers trans (M3)/cis (M4) -3,4-dihydroxyhaplamine formation. Cytotoxic essays on the different human cancer lines (colic : HT29, LS174T, SW620 ; pancreatic : Capan-1, Capan-2 and hepatic : HepG2) were tested with haplamine and its metabolites M3 and M4. The biotransformation compounds don’t have any cytotoxic property; in contrast haplamine shows certain activities on the pancreatic line Capan-2. This observation was confirmed by the death cells study that demonstrate an important induction of early and late apoptosis and necrosis by haplamine.