Development of carbon-based nanomaterials and their use as new therapeutic carriers

par Cédric Klumpp

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Alberto Bianco et de Maurizio Prato.

Soutenue en 2006

à l'Université Louis Pasteur (Strasbourg) en cotutelle avec Trieste - Italie .

  • Titre traduit

    Développement de nanomatériaux de carbone et leurs utilisations comme nouveaux vecteurs thérapeutiques


  • Résumé

    Les fullerènes et les nanotubes de carbones sont des nouveaux allotropes du carbone qui ont été découverts en 1985 et 1991 respectivement. Les fullerènes sont des billes de quelques angströms. Théoriquement, ils sont composés d’au moins 20 atomes de carbones mais peuvent en contenir jusqu’à plusieurs centaines. L’isomère le plus stable et le plus abondant est le C60 qui est formé de 12 pentagones et 20 hexagones arrangés en forme sphérique. Les nanotubes quant à eux peuvent être définis comme une feuille de graphite enroulée pour former une structure cylindrique ou les extrémités sont constituées d’un demi-fullerène. Il existe plusieurs types de nanotubes, les monofeuillets et les multifeuillets. Les différentes propriétés physiques et chimiques des fullerènes et des nanotubes de carbones ont déjà permis de trouver de multiples applications dans le domaine des matériaux. Néanmoins, les recherches sur leurs applications potentielles dans le domaine biologique ou médical sont moins avancées. Les laboratoires de recherche ou j’ai conduit ma thèse se sont spécialisés dans le développement de dérivés de fullerènes ainsi que de nanotubes de carbones à des fins thérapeutiques. Durant ma thèse de doctorat, je me suis donc intéressé à la fonctionnalisation, à la caractérisation ainsi qu’aux applications biologiques potentielles des fullerènes et des nanotubes de carbones. A l’heure actuelle, la caractérisation des nanotubes par les différentes techniques analytiques à notre disposition ne nous permettent pas de confirmer en même temps la présence de nanotubes, celle de groupements chimiques liés et la nature de cette liaison. Nous avons donc rassemblé un maximum d’information avec plusieurs techniques, telles que la résonance magnétique nucléaire, la microscopie électronique et à force atomique ainsi que par analyse thermogravimétrique. Dans un second temps, nous avons focalisé notre attention sur des études de biodistribution et d’élimination des nanotubes fonctionnalisés in vivo. L’étude a été effectuée avec des nanotubes simples et/ou multifeuillets fonctionnalisés avec le radiotraceur indium 111. Les conjugués ont ensuite été injectés dans des souris et la radioactivité a été mesurée dans les différents organes au bout de 30 minutes, 3 heures et 24 heures. Tous les organes présentaient déjà une radioactivité réduite après 30 minutes, chutant rapidement à zéro après 24 heures, indiquant une élimination rapides de ce type de nano-objets. Le mode d’évacuation des nanotubes dans cette expérience s’est révélé être la voie rénale. En effet, les images obtenues par microscopie électronique à transmission (TEM) ont confirmé la présence des nanotubes dans les urines. Les souris n’ont présentés aucun trouble même après l’injection d’une forte dose de tubes. Ces résultats confirment que les nanotubes n’ont pas d’effets toxiques à courts termes. Leur capacité à vectoriser un médicament a ainsi été envisagée. Pour ce faire, l’amphotéricine B a été attachée à la surface de nanotubes. En effet, cette molécule est un puissant antifongique, cependant son utilisation reste limitée car elle présente une forte toxicité pour les patients. Les conjugués monofeuillet et multifeuillet liés à l’amphotéricine B se sont révélés très intéressants, d’une part parce qu’ils ont augmenté l’efficacité de l’antifongique face à différents souches de champignons, mais aussi parce qu’ils ont permis de modérer les effets secondaire de cet agent sur les cellules de mammifères. Nous avons donc établis que les dérivés de nanotubes de carbones peuvent être utilisés comme vecteurs, parce qu’ils ne sont pas toxiques et qu’en plus ils améliorent l’efficacité des médicaments tout en réduisant leurs effets secondaires. Nous nous sommes également intéressés à l’utilisation des fullerènes comme vecteurs potentiels. Cette étude a d’abord nécessité la synthèse et la caractérisation de fullerènes polyfonctionnalisés. Ainsi, une méthode a été mise au point pour obtenir des fullerènes modifiés avec une certaine distribution de groupements fonctionnels par l’emploi de la cycloaddition 1,3-dipolaire d’hylures d’azométhine. L’utilisation de groupements ammonium a notamment permis une grande solubilité des dérivés de fullerènes en solution aqueuses. La caractérisation de ces dérivés a été réalisée par différentes techniques analytiques tels que la chromatographie en phase liquide à haute performance, la spectrométrie de masses et la résonance magnétique nucléaire. Les expériences ont révélé que ces composés renferment des groupements ammonium qui leurs permettent d’être hautement solubles dans les solutions aqueuses. Par la suite, l’attachement d’un fluorophore a permis de tester la toxicité de ces dérivés par cytométrie en flux, afin de sélectionner ceux qui présentaient une compatibilité pour les milieux biologiques. Parallèlement, la capacité des fullerènes fonctionnalisés à franchir la membrane cytoplasmique a été évaluée par microscopie confocale. Dans un second temps, la warfarine, une molécule anticoagulante a été liée dans le but d’utiliser les dérivés du fullerène en tant que vecteur et d’établir si une multiprésentation sur la surface du fullerène de celle-ci pourrait améliorer son efficacité. Nous avions précédemment montré la capacité des nanotubes comme vecteurs pour modifier des gènes. De ce fait, des dérivés polycationiques du fullerène ont été préparés pour évaluer leur affinité à complexer l’ADN. Les études TEM et de gels d’électrophorèse ont confirmé la présence des complexes et les expériences de résonance plasmonique de surface ont permis de mesurer la constante d’affinité de ces derniers. Les dérivés du fullerène sont potentiellement capables de vectoriser l’ADN à l’intérieur des cellules. Dans le but de vérifier cette hypothèse, des études de transfert de gènes ont déjà été commencées. En conclusion, la préparation de nanotubes ainsi que de fullerènes pour diverses applications biologiques telles la vectorisation de médicaments ou de gènes a été décrite. Les diverses analyses montrent que les nanotubes ne présentent pas de toxicité et peuvent améliorer les performances de molécules antifongiques. Parallèlement, les fullerènes multifonctionnalisés présentent des caractéristiques similaires aux nanotubes et ont donc un potentiel comme vecteurs thérapeutiques. Finalement, les matériaux à base de carbone offrent des perspectives encourageantes pour des applications biomédicales.


  • Résumé

    Fullerenes and carbon nanotubes are new allotropes of carbon discovered in 1985 and 1991 respectively. Fullerenes are spheres of few angströms theoretically constituted of at least 20 carbon atoms. The most stable and abundant isomer is the C60 which is formed of 12 pentagons and 20 hexagons. Carbon nanotubes are basically a rolled sheet of graphite terminated by two end caps similar to a half C60. Two main types of nanotubes exist: i) the single-walled carbon nanotubes which are composed by a rolled monolayered graphene sheet, and ii) the multi-walled carbon nanotubes which possess several graphitic concentric layers. The different chemical and physical properties of fullerenes and carbon nanotubes allowed finding already applications in the field of material sciences. Nevertheless, the search on their potential applications in the biological or medical field is still little explored. The different laboratories where I conducted my thesis are specialized in the development of fullerene and carbon nanotubes derivatives for therapeutics purposes. During my PhD thesis, I focused my interests on the functionalization and the characterization of fullerenes and carbon nanotubes and their potential biological applications. Nowadays, the characterization of functionalized nanotubes remains very complicate because the current techniques does not allow establishing simultaneously the presence of the carbon nanotubes, the presence of functional groups and the presence of covalent bonding between the tube and the functional moiety. Several techniques were therefore used like the nuclear magnetic resonance, the transmission electron microscopy, the atomic force microscopy and the thermogravimetry analysis to gather a maximum of data on the functionalized nanotubes. We studied then the biodistribution and elimination of functionalized carbon nanotubes in vivo. For this purpose, single or multiwalled carbon nanotubes were functionalized with the radiotracer indium 111. The conjugates were then injected in mice and the radioactivity was measured in the different organs after 30 minutes, 3 hours and 24 hours. Radioactivity was detected in every organ after 30 minutes and almost disappeared after 24 hours. These results indicated that the nanotube elimination process was fast. Moreover, transmission electron microscopy analysis of the urine revealed that the carbon nanotubes were eliminated via the renal excretion. No signs of toxicity were detected on the mice, meaning that functionalized nanotubes are biocompatible. Thus, we envisaged to use the carbon nanotubes as new vectors for therapeutic molecules. Amphotericin B was linked onto the surface of the carbon nanotubes and the conjugates were tested on several strains of fungi and on mammalian cells as well. It appeared that the carbon nanotube conjugates were more potent than the drug alone against the fungi and allowed also reducing the toxicity of the amphotericin B on mammalian cells. Alternatively, we explored the use of fullerene as potential vector systems. We described the synthesis and characterization of multi-functionalized fullerene derivatives. In this context, the 1,3-dipolar cycloaddition reaction of azomethine ylides was applied to obtain functionalized fullerene bearing a distribution of organic moieties around the spherical cage. Their characterization was realized by several techniques such as high pressure liquid chromatography, mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. Moreover, the introduction of ammonium groups on the surface of C60 greatly increased the solubility in aqueous media. The linkage of a fluorescent probe on the fullerene derivatives permitted to evaluate by flow cytometry and confocal microscopy their biological compatibility and their potential to cross the plasma membrane. Secondly, warfarin, an anticoagulant molecule, was attached in order to use the fullerene derivatives as a drug delivery system and to determine if a multi-presentation of the biomolecule could enhance its effect. Previously, we reported the capacity of nanotubes to act as gene vectors. Thus, polycationic fullerenes were prepared to evaluate their ability to complex DNA. The complexes were characterized by gel electrophoresis and transmission electron microscopy. In addition, surface plasmon resonance allowed measuring the affinity constant. The fullerene derivatives are potentially able to deliver DNA inside the cells. In order to verify this hypothesis, gene transfer studies have already started. In conclusion, the preparation of functionalized carbon nanotubes and fullerenes for biological applications was reported. Notably, carbon nanotubes derivatives are non-toxic and can deliver antifungal molecules and modulate their cytotoxic effects. In the same way, fullerene derivatives were able to penetrate the plasma membrane without provoking cytotoxicity and to strongly complex plasmid DNA. Therefore, they could be used as a potential vector for gene and drug delivery. Finally, functionalized carbon-based nanomaterials can be considered an efficient alternative system for the delivery of therapeutics and may find interesting future biomedical applications.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (175 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 159-171. Index

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université de Strasbourg. Service commun de la documentation. Bibliothèque Blaise Pascal.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2006;5228
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