Etude du rôle de la boucle C-terminale des récepteurs NPY Y1 et Y2 : Couplage biologique et séquences de régulation du trafic intracellulaire des récepteurs

Role of the C-terminal tail of the NPY receptors Y1 and Y2 : Biological coupling and sequences involved in the regulation of intracellular trafficking of the receptors

• Auteur / Autrice : Moussa Ouedraogo
• Direction : Bernard Bucher
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance en 2006
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Hybrides somatiques

Mutation (biologie)

Protéine fluorescente verte

Adénylate-cyclase

Neurohormones

Neuropeptide Y

Résumé

Le neuropeptide Y est une neurohormone impliquée dans de nombreuses fonctions physiologiques et états pathologiques. Il active différents récepteurs Y1, Y2, Y4 et Y5, tous couplés négativement à l'adénylyl cyclase via la protéine Gi/o. Les mécanismes de régulation de l'activation de ces récepteurs sont très peu documentés. Le laboratoire a montré que le récepteur Y1 est internalisé et recyclé à la membrane en réponse à l'activation par l'agoniste. Ceci n'est pas observé pour les récepteurs Y2, Y4, Y5. Il est alors d'un apport fondamental de comprendre les bases structurales de l'internalisation rapide du récepteur Y1 notamment à travers l'évaluation de l'importance de la boucle C-terminale dans la signalisation et le processus d'endocytose. Nous avons généré des récepteurs par mutation ponctuelle ou troncations progressives du domaine C-terminale de Y1 et des chimères par l'échange du domaine C-terminal entre les récepteurs Y1 et Y2. Ces récepteurs sont tous fusionnés à l'EGFP à l'extrémité N-terminale. Ils ont été transfectés dans des cellules HEK293. Nous avons ensuite caractérisé la fonctionnalité et analysé le profil de trafic intracellulaire des récepteurs. Nos résultats montrent que la boucle C-terminale du récepteur Y1 est critique pour l'endocytose du récepteur stimulé par l’agoniste mais n'est pas indispensable à son couplage à l’adénylyl cyclase et à sa désensibilisation. L'endocytose du récepteur Y1 stimulé par l’agoniste est sous le contrôle de deux motifs localisés sur les boucles C-terminale et i2. Le récepteur Y2 qui n’est pas internalisé dans les mêmes conditions possède uniquement le motif présent dans le domaine C-terminal. Par ailleurs, la troncation des 27 ou 32 derniers acides aminés du domaine C-terminal a permis de mettre en évidence une internalisation constitutive du récepteur qui est inexistante sur le récepteur Y1 natif. Elle serait due au motif consensus YXX démasqué par la troncation et/ou au changement conformationnel du récepteur.

Neuropeptide (NPY) is a neurohormone involved in many physiological functions and pathophysiological states. NPY activates various receptors Y1, Y2, Y4 and Y5. All are seven transmembrane domains receptors negatively coupled to the adenylyl cyclase via a Gi/o protein. The regulation of the activity of NPY receptors is not well documented. Recent study in the laboratory showed that the Y1 receptor is internalized and recycled to cell membrane upon agonist stimulation. Surprisingly, we did not observe internalization of the other Y2, Y4, Y5 receptors under the same conditions. It is therefore crucial to understand structural bases of the rapid internalization of the Y1 receptors by evaluating the importance of the C-terminal loop in the process of receptor endocytosis. To do so, we generated receptors punctually mutated or progressively deleted amino acids from its C-terminal tail and chimeric receptors resulting from the exchange of C-terminal tails between Y1 and Y2 receptors. All constructs were coupled to the EGFP in N-terminal and transfected in HEK 293 cells. We thereafter checked their functionality and analyzed the intracellular profile of receptors trafficking. Data showed that the C-terminal tail of the Y1 receptor is critical for receptor internalization mediated by the NPY but neither essential to its coupling with the adenylyl cyclase nor the receptor desensitization. The internalization induced by the agonist requires the presence of two motifs located on the C-terminal domain and i2 loop of the Y1 receptor. The Y2 receptor which is not internalized present only one of them localized in the C-terminal domain. In addition, deletion of the 27 or the last 32 amino acids of the C-terminal tail showed a constitutive endocytosis of the receptor which is not present in wild-type Y1 receptor. This tonic regulation of the truncated receptors would be due to the consensus motif YXX uncovered by truncation and/or to a conformational change of the receptor.