Etude du canal responsable du transfert de l'ammoniac au sein de la glucosamine-6P synthase d'E. Coli

par Stéphane Mouilleron

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Marie-Ange Badet-Denisot.


  • Résumé

    La Glucosamine-6-phosphate synthase (GlmS) est une enzyme clé de la voie de biosynthèse des hexosamines et appartient à. La famille des amidotransférases glutamine dépendante de classe II. Elle catalyse la transformation du fructose-6-phosphate en glucosamine-6-phosphate en utilisant l'azote amidique de la glutamine comme seule source d'azote. Une structure de la GlmS cristallisée en présence de fructose-6-phosphate a été résolue en 2001 à une résolution de 3,1 Â. Cette structure montre l'existence d'un canal long de 18 Â reliant les deux sites actifs de l’enzyme et permettant le transfert de l’ammoniac du site glutaminase jusqu'au site accepteur. Cependant, dans cette structure, le canal est fermé par l’indole du résidu Trp74 et donc dans une conformation incompatible avec le transfert de l’ammoniac. Dans le cadre de l'étude de ce canal, nous avons résolu deux structures de la GlmS, la première en présence de fructose-6-phosphate à une résolution de 2,05 A et la deuxième, à une résolution de 2,35. Â. , en présence de fructose-6-phosphate et. De 6-diazo-5-oxo-norleucine (DON), un inhibiteur irréversible du site glutaminase qui mime un intermédiaire réactionnel de l’hydrolyse de la glutamine. Cette deuxième structure nous a permis d’observer pour la première fois le canal ammoniac de la GlmS dans une conformation ouverte, le Trp74 participant dans ce cas à la paroi du canal. La comparaison des deux structures a montré que l’occupation du site glutaminase par le DON induit une rotation de 75° de l’indole du Trp74, permettant l’ouverture du canal ammoniac et a révélé les changements de conformations déclenchés par l’occupation du site glutaminase, conduisant à l’activation de la fonction glutaminase. Nous avons ensuite poursuivi l’étude du canal par mutagénèse dirigée en tentant de le perforer. Pour cela, nous avons produit trois mutants de la GlmS où le résidu Trp74 est muté en alanine, leucine ou phénylalanine. Les paramètres cinétiques de ces trois mutants montrent que la majorité de l’ammoniac produit par l’enzyme est relargué dans le milieu.


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Informations

  • Détails : 1 vol. (190 f.)
  • Annexes : Bibliogr. f. 180-190

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 0g ORSAY(2006)355
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