Implication du PTS dans la régulation de PrfA, activateur transcriptionnel des gènes de virulence de listeria monocytogenes

par Rana Herro

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Josef Deutscher.


  • Résumé

    L’activité de PrfA, régulateur transcriptionnel de nombreux gènes de virulence de Listeria monocytogenes, dont hly est inhibée par des sucres rapidement métabolisés comme le glucose et le fructose. Cette inhibition ne suit pas le mécanisme général de répression catabolique des firmicutes, car l’inactivation de ccpA (Catabolite Control Protein A) ne lève pas à la répression de l’expression des gènes de virulence exercée par le glucose ou le fructose. Dans le but de tester si le co-répresseur P-Ser-HPr serait impliqué dans la régulation de l’activité de Prfa, nous avons utilisé la souche BUG1199 de B. Subtilis, qui contient intégrés à son génome, prfA sous contrôle du promoteur pspac qui est inductible à l’IPTG et la fusion hly-lacZ. La formation de la P-Ser-Hpr requiert l’intervention d’une enzyme bifonctionnelle l’HPrkinase/phosphorylase (HPrK/P), qui en fonction de la concentration de certains métabolites, soit phosphoryle HPr sur sa Ser-46, soit déphosphoryle la P-Ser-Hpr. L’allèle kprKV267 F codant pour une HPrK/P aui a conservé une activité kinase normale mais ne possédant quasiment plus d’activité phosphorylase, favorise l’accumulation de la P-Ser-HPr dans la cellule. L’introduction de la mutation hprKV267f dans BUG1199 inhibe fortement l’activité de PrfA. La subsitution dans HPr de la Ser-46 par une alanine empêche la formation de la P-Ser-HPr et restaure l’activité de PrfA, alors que l’inactivation de CcpA n’a aucun effet. Cependant l’interruption de ccpA dans BUG1199 à kprK sauvage, inhibe l’activité de PrfA. Cette répression de l’activité de PrfA dans le mutant ∆ccpA est probablement due aussi à l’accumulation de P-Ser-HPr dans la cellule, car elle est levée lorsque le Ser-46 dans HPr est remplacé e par une alanine. Outre sa phosphorylation sur la Ser-46-HPr est également phosphorylée sur son His-15 par l’enzyme I (EI) via la cascade de phosphorylation PEP-dépendante du PTS (Phosphoenolpyruvate carbohydrate phospho Transferase System). Cependant la P-Ser-HPr est un mauvais substrat pour l’EI, ce qui favorise probablement l’inhibiton de PrfA. En effet, l’interruption des gènes codant pur HPr et/ou EI, inhibe également l’activité de PrfA. Ainsi pour être active, PrfA a besoin d’un PTS fonctionnel.


  • Résumé

    The activity of the Listeria monocytogenes transcription activator PrfA, which is required for the expression of several virulence genes, including the hemolysin-encoding hly, is inhibited by the presence of glucose, fructose and other rapidly metabolizable carbon sources. This inhibition is not mediated via the main carbon catabolite repression mechanism operative in Gram-positive bacteria, since inactivation of the catabolite control protein A (CcpA) did not prevent repression of virulence genes by the above sugars. We used a Bacillus subtilis strain (BUG1199) containing the PrfA gene under control of an IPTG-inducible promoter and the lacZ reporter gene fused to the PrfA-activated L. Monocytogens hly promoter to test whether the catabolite co-repressor P-Ser HPr might be involved in PrfA regulation. Indeed, accumulation of P-Ser-HPr in an hprK mutant (hpr KV267F) producing HPr kinase/phosphorylase (HprK/P) with normal kinase, but almost no phosphorylase activity strongly inhibited transcription activation by PrfA even in the absence of a repressing surgar. In response to the concentration of certain metabolites, the bifunctional HprK/P either phosphorylates HPr at Ser-46 (kinase function) or dephosphorylates P-Ser-HPr (phophorylase function). Preventing the formation of P-Ser-HPr in the hprKV267F mutant by replacing Ser-46 in Hpr with an alamine restored PrfA activity. In constrat, inactivation of crh, which encodes a HPr homologue that also becomes phosphorylated at Ser-46, did not enhance PrfA activity. PrfA in the hprKV267F mutant also remained inactive when the ccpA gene was mutated. In fact, disruption of ccpA in the hprK wild-type strain BUG1199 also led to the inactivation of PrfA, which is in agreement with previous findings that ccpA mutants contain large amounts of P-Ser-HPr similar to the hpr KV267F mutant. It therefore seems that elevated concentrations of P-Ser-HPr due either to growth on rapidly metabolisable carbon sources of to specific mutations directly or indirectly inhibit PrfA activity. To carry out its catalytic function in sugar transport, HPr of the phosphotransferase system (PTS) is also phosphorylated by phosphoenolpyruvate and enzyme I at His-15. However, P-Ser-HPr is only very slowly phosphorylated by enzyme I, which probably accounts for PrfA inhibition. In agreement with this concept, disruption of the enzyme I- or HPr-encoding genes also strongly inhibited PrfA activity. PrfA activity therefore seems to depend on a fully functional PTS phosphorylation cascade.

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  • Détails : 1 vol. (177 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 139-177

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 0g ORSAY(2006)347
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