Stabilité des anticorps recombinants : mesure, amélioration, applications

par Elodie Monsellier

Thèse de doctorat en Structure, fonction et ingéniérie des protéines

Sous la direction de Hugues Bédouelle.

Soutenue en 2006

à Paris 7 .


  • Résumé

    LES ANTICORPS RECOMBINANTS ONT DE NOMBREUSES APPLICATIONS, LIMITEES PAR UNE STABILITE INSUFFISANTE. NOUS VOULIONS DEVELOPPER UNE METHODE SIMPLE ET ROBUSTE DE STABILISATION DES FRAGMENTS D'ANTICORPS, ET COMPRENDRE LES MECANISMES DE STABILISATION CORRESPONDANTS. NOUS AVONS DEVELOPPE UNE METHODE FIABLE ET PRECISE POUR MESURER LA STABILITE DES FRAGMENTS D'ANTICORPS. POUR CELA, NOUS AVONS ETABLI UNE LOI RIGOUREUSE DU SIGNAL POUR LA LONGUEUR D'ONDE DU MAXIMUM DE FLUORESCENCE LMAX. LES TERMES CORRECTIFS A APPORTER A LA STABILITE ΔG(H2O) ET AU COEFFICIENT DE COOPERATIVITE m, OBTENUS EN UTILISANT UNE LOI LINEAIRE EMPIRIQUE DU SIGNAL POUR LMAX, ETAIENT MESURABLES EXPERIMENTALEMENT. NOUS AVONS PREDIT AVEC SUCCES UN ENSEMBLE DE MUTATIONS STABILISATRICES SUR LE FRAGMENT MODELE scFvD1. 3, EN UTILISANT DES CRITERES COMPLEMENTAIRES DE STRUCTURES, SEQUENCES ET DONNEES EXPERIMENTALES SUR LES ANTICORPS. UN DERIVE RECOMBINANT CES MUTATIONS AVAIT UNE TRES HAUTE STABILITE, UNE AMELIORATION DE STABILITE ΔΔG(H2O) SUPERIEURE A CELLES PUBLIEES PRECEDEMMENT, UNE ACTIVITE CYTOPLASMIQUE AMELIOREE, ET UNE AFFINITE INCHANGEE POUR L'ANTIGENE. NOS REGLES DE CONCEPTION PERMETTAIENT DE PREDIRE LES EFFETS DES MUTATIONS DE FAÇON QUALITATIVE POUR ΔG(H2O) ET QUANTITATIVE POUR LA CONCENTRATION EN UREE DE DEMI-DENATURATION. L'ACCROISSEMENT DE m CONSTITUAIT UN MECANISME IMPORTANT DE STABILISATION. LES EFFETS DES MUTATIONS DEPENDAIENT DU CONTEXTE STRUCTURAL. CES RESULTATS INDIQUAIENT L'EXISTENCE DE STRUCTURES RESIDUELLES DANS L'ETAT DENATURE DU TYPE PARENTAL. CETTE METHODE A ETE APPLIQUEE A LA STABILISATION DTMMUNOCAPTEURS FLUORESCENTS AUTONOMES, QUI POURRONT SERVIR DE BASE A LA CONSTRUCTION DE PUCES A PROTEINES.

  • Titre traduit

    Stability of recombinant antibodies. Measure, improvement, applications


  • Résumé

    RECOMBINANT ANTIBODIES HAVE A NUMBER OF APPLICATIONS, SOME OF THEM LIMITED BY A LOW STABILITY. WE INTENTED TO DEVELOP A SIMPLE AND ROBUST METHOD TO IMPROVE RECOMBINANT ANTIBODIES STABILITY, AND TO UNDERSTAND THE UNDERLYING MECHANISMS OF STABILISATION. WE DEVELOPED A RELIABLE METHOD TO PRECISELY MEASURE THE STABILITY OF ANTIBODY FRAGMENTS. WE ESTABLISHED A RIGOROUS LAW OF THE SIGNAL FOR THE WAVELENGTH OF THE MAXIMUM FLUORESCENCE INTENSITY LAMBDA MAX. THE STABILITY ΔG(H2O) AND THE COEFFICIENT OF COOPERATIVITY m WHEN THE EMPIRICAL LINEAR LAW OF THE SIGNAL IS APPLIED, HAVE TO BE CORRECTED. THE CORRECTIVE TERMS CAN BE DETERMINED EXPERIMENTALE Y. USING COMPLEMENTARY CRITERIA OF SEQUENCE, STRUCTURE AND EXPERIMENTAL DATA ON ANTIBODIES, WE FRAGMENT, COMBINING ALL THE DESIGNED MUTATIONS, HAD A PARTICULARLY HIGH STABILITY, A STABILITY IMPROVEMENT COMPARED TO THE WILD-TYPE HlGHER THAN REPORTED SO FAR BY ANY METHOD, AN INCREASED CYTOPLASMIC ACTIVITY, AND AN UNMODIFIED AFFINITY FOR THE ANTIGEN. OUR RULES OF DESIGN ALLOWED US TO PREDICT THE EFFECTS OF MUTATIONS QUALITATIVELY FOR ΔG(H2O) AND QUANTITATIVELY FOR THE CONCENTRATION OF UREA AT HALF-DENATURATION. THE IMPROVEMENT OF m WAS AN IMPORTANT MECHANISM OF STABILISATION. THE EFFECTS OF MUTATIONS DEPENDED OF THE STRUCTURAL CONTEXT. THESE RESULTS INDICATED THE EXISTENCE OF RESIDUAL STRUCTURES IN THE DENATURATE STATE OF THE WILD-TYPE. WE THEN USED THIS METHOD TO IMPROVE THE PRODUCTION LEVEE AND THE LIFE-SPAN OF REAGENTLESS FLUORESCENT IMMUNOSENSORS, WHICH COULD BE USED FOR THE DEVELOPMENT OF ANTIBODY ARRAYS.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (198 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 229 réf.

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2006) 190
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