Caractérisation de l'endonucléase de homing I-SpomI et son application dans l'étude de la stabilité des génomes des eucaryotes

par Stefan Pellenz

Thèse de doctorat en Génétique

Sous la direction de Bernard Dujon.

Soutenue en 2006

à Paris 7 .

  • Titre traduit

    Characterization of the homing endonuclease l-Spoml and its application in the study of the stability of eukaryotic genomes


  • Pas de résumé disponible.


  • Résumé

    Ce travail traite une nouvelle endonucléase de homing, baptisée l-Spoml, de la levure S. Pombe. L-Spoml consiste en 304 acides aminés de la phase ouverte de lecture comprenant cox1E1 et cox1I1b. L-Spoml fait partie de la famille dodecapeptide des endonucléases de homing à cause de la présence de deux motifs LAGLIDADG ainsi que tous les éléments nécessaires caractéristiques de toutes les protéines LAGLIDADG connues à ce jour. L-Spoml coupe dans le gène coxl de S. Pombe si son intron hôte n'est pas présent dans la séquence. La version courte de la phase ouverte de lecture (codant l-Spoml) a été exprimée dans E. Colï, la protéine a été purifiée en utilisant une chromatographie d'affinité. La protéine purifiée possède une activité endonucléolytique spécifique in vitro. Les conditions optimales de clivage ont été définies de façon suivante: 5 à 7. 5mM de Mg2+, 60 à 80mM Na+, 42°C et pH 9. 6. Nous avons déterminé le site de coupure autour du site d'insertion de l'intron et montré que le clivage génère des bouts 3' sortant de 4pb. Le site de reconnaissance de l-Spoml a été défini: il comprend 20nt dont 16nt sont essentiels à la reconnaissance du substrat. Puis, nous avons cherché de générer des cassures double-brin dans les génomes de S. Cerevisiae et S. Pombe avec l-Spoml. Nous avons utilisé l-Scel pour arriver à ce but. Suite à l'insertion d'un marqueur bordé par deux sites de cet enzyme nous avons pu induire des CDBs dans le génome de S. Pombe. Le marqueur a été perdu dans 70% des cas après expression de l-Scel. Les CDBs ont été réparées par NHEJ en absence d'une matrice de réparation extrachromosomique mais majoritairement par recombinaison homologue en présence d'une telle matrice.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (265 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 341 réf.

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • PEB soumis à condition
  • Cote : TS (2006) 147
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