Étude de la différenciation neuro-ectodermique des cellules souches embryonnaires murines : rôle du morphogène BMP-4

par Karen Gambaro

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Matthieu Rouleau et de Daniel Aberdam.


  • Résumé

    During vertebrate gastrulation, the morphogene BMP-4 which is a membre of the TGF-β superfamily, has a key role in the neural and epidermal commitment in the embryo. Crutial in the choise between epidermal and neural fate of cells derived from the ectoderm, the BMP-4 promotes epidermal differentiation while the inhibition of the BMP-4 activity leads to neuroectodermal commitment. Many in vitro studies showed that BMP-4 as an epidermal inductor inhibits neural differentiation, however, the molecular events and genes involved in this process remain unknown. Non neural ectoderm is constituted of a single layer of epithelial cells which express cytokeratins 8 and 18. Epidermic commitment and stratification are caracterised by the expression of epidermal markers such cytokeratins 5 and 14. P63, a member of the p53 family, plays a major role both in epidermal commitment, maintenance and epidermal regeneration. Nevertheless, the molecular role of p63 in early steps of epidermal morphogenesis remained controversial and the fonctions of the different p63 isoforms should be clarified. Mouse Embryonic Stem cells (ES) represente an ideal tool to study mecanisms underlying neural inhibition and epidermal commitment during embryogenesis. ES cells derived from the inner cell mass of the blastocyste, at one of the earliest stages of the development of the embryo. Undifferentiating ES cells are pluripotent and capable of undergoing an unlimited number of symetrical divisions with no genetic modification (self-renewal). But under controled culture conditions ES cell can differentiate into all the cell type of the body can be used to identify all steps leading to the formation of a given cell type. Using ES cells technology, my thesis work focused on the molecular events underlying neural inhibition induced by BMP-4 and on identification of genes which are important in the early development of epidermis. In this way, we described culture conditions allowing efficient neural differentiation of ES cells and we demonstrate for the first time, that BMP-4 treatment induces mitochondrial damages in differenciated ES cell, leading to caspase-dependent apoptosis in a dose-dependent maner. Remarkably, the proapoptotic effect of BMP-4 targets the Sox-1 precursor cells which are early commited to neural fate. Furthermore, we show that the BMP-4 signal requieres a fonctional Smad pathway and induces expression of Msx-1 and Msx-2 genes. In the other hand, we show that BMP-4 promotes consecutively expression of ectodermal markers such cytokeratins 8 and 18 and epidermal markers such cytokeratins 5 and 14. During epidermal commitment of ES cells, we show that BMP-4 induces the transcriptional expression of the ΔNp63 isoform in ES cell-derives epithelial and epidermal cells. The expression pattern and the role of ΔNp63 in the neuro-epidermal differenciation will be discussed. Our results show that globally ES cells differentiating in vitro recapitulate the molecular events governing the in vivo differentiation. This model allowed us to caracterise and to understand the crutial role of BMP-4 in the neuro-ectodermal commitment. Analysis of genes (known and unknown) which are modulated during keratinocyte differenciation will allow us to identify responsible actors in this commitment.

  • Titre traduit

    Neuro-ectodermal differentiation of mouse embryonic stem cells : role of the morphogene BMP-4


  • Résumé

    Au cours de l'embryogenèse précoce, au stade gastrula du développement, le BMP-4 qui est un morphogène de la superfamille des TGF-β, a un rôle clé dans la mise en place des territoires épidermique et neuronal dans l'embryon. Crucial pour le choix entre un destin épidermique ou neuronal des cellules ectodermiques, il induit par son action directe la différenciation épidermique alors que l'inhibition de son activité entraîne la différenciation du neuroectoderme. Plusieurs études in vitro ont montré que le BMP-4 inhibe la différenciation neuronale au profit de la différenciation épidermique mais les évènements moléculaires ainsi que les gènes impliqués dans ces évènements au cours du développement sont largement inconnus. L'ectoderme non neuronal est constitué d'une seule couche de cellules épithéliales exprimant les cytokératine 8 et 18. L'engagement vers la différenciation épidermique et la stratification se caractérisent par l'apparition des marqueurs épidermiques telles que les cytokératines 5 et 14. La protéine p63, un homologue de p53, a un rôle crucial, non seulement dans les étapes d'initiation de l'engagement épidermique, mais dans le maintien et la régénération de l'épiderme. Néanmoins de nombreuses questions restent à clarifier sur les fonctions exactes des différentes isoformes de ce gène dans les étapes précoces du développement épidermique. Le modèle des cellules souches embryonnaires (ES) est l'outil idéal pour l'étude des mécanismes impliqués dans l'inhibition neuronale et l'engagement épidermique au cours du développement précoce. Ces cellules, issues de la masse interne du blastocyste, ont en effet les propriétés, notamment, d'être pluripotentes, de proliférer indéfiniment sans modification du patrimoine génétique et d'être facilement modulables pour un ou plusieurs gène(s) donné(s). Elles permettent donc d'identifier toutes les étapes aboutissant à la formation d'un type cellulaire. L'étude qui a fait l'objet de mon travail de thèse a eu pour but de comprendre, grâce à la technologie des cellules ES, les mécanismes moléculaires à l'origine de l'inhibition neuronale induite par le BMP-4 et d'identifier les gènes qui sont impliqués dans le développement précoce de l'épiderme. Pour cela nous avons mis au point des conditions de culture efficaces qui favorisent la différenciation neuronale des cellules ES et nous démontrons pour la première fois, par différentes approches expérimentales, que le signal délivré par le BMP4 aboutit à une atteinte mitochondriale des cellules en différenciation et induit l'apoptose caspase dépendante de ces cellules, et ce de manière dose dépendante. De manière remarquable, l'effet pro-apoptotique du BMP-4 cible les cellules SOX-1 positives, cellules qui sont engagées très précocement dans une différenciation neuronale. Nous montrons également que le signal délivré par le BMP4 passe par la voie des Smads et induit l'expression de gènes tels que Msx1 et Msx2. D'autres part, nous montrons que le BMP-4 induit consécutivement l'expression des marqueurs de la différenciation ectodermique comme les cytokératines 8 et 18 et les marqueurs de la différenciation épidermique comme les cytokératines 5 et 14. Au cours de cet engagement épidermique des cellules ES, nous montrons que le BMP-4 induit la transcription et l'expression de l'isoforme ΔNp63 dans les cellules épithéliales et épidermiques nouvellement différenciées. Le profil d'expression et le rôle de p63 dans la différenciation neuro-épidermique des cellules ES seront discutés. Les résultats obtenus montre que les cellules ES se différencient in vitro selon un programme génétique similaire à celui qui régit le développement embryonnaire in vivo. Ce modèle nous a permis de comprendre et de caractériser le rôle central que tient le BMP4 dans l'engagement neuroectodermique. L'analyse des gènes (connus et inconnus) modulés par le BMP4 au cours de l'engagement kératinocytaire nous permettra d'identifier les acteurs responsables de cette différenciation.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (148 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 109-147. Résumés en français et en anglais

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université Nice Sophia Antipolis. Service commun de la documentation. Section Sciences.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : 06NICE4034
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