Caractérisation et purification partielle de l'activité méthyltransférase spécifique de la HBHA, adhésine majeure de M. Tuberculosis

par Hélène Host

Thèse de doctorat en Biochimie et biologie

Sous la direction de Camille Locht et de Franco Dante Menozzi.

Soutenue en 2006

à Lille 2 .


  • Résumé

    Mycobacterium tuberculosis, l'agent responsable de la tuberculose, est à l'origine de deux millions de décès chaque année dans le monde. La HBHA de Mycobacterium tuberculosis est un facteur de virulence majeur impliqué dans le mécanisme de dissémination extrapulmonaire qui constitue une étape-clef de la pathogenèse de la tuberculose. Il a été montré que le domaine C-terminal fait l'objet d'une méthylation post-traductionnelle, nécessaire en particulier à l'induction d'une réponse protectrice contre une infection à Mycobacterium tuberculosis dans le modèle murin. Cette modification n'a pas lieu lorsque la HBHA est exprimée sous forme recombinante chez Escherichia coli. Le but de cette étude est de caractériser et purifier l'activité méthyltransférase responsable de la modification post-traductionnelle de la HBHA. Nous exposons ici la mise au point d'un test de méthylation in vitro hautement sensible, reposant sur l'anticorps monoclonal E4. En effet, E4 reconnaît de manière forte la HBHA lorsqu'elle est méthylée, et seulement faiblement la protéine recombinante non méthylée produite chez E. Coli. Ainsi, nous avons montré que la présence du domaine N-terminal n'est pas nécessaire à la modification du domaine C-terminal de la protéine : il est en effet possible de méthyler in vitro, en utilisant un lysat de mycobactéries comme source d'enzyme, une protéine hétérologue sur laquelle est greffé le domaine C-terminal de la HBHA. Ce résultat a été confirmé par des analyses en spectrométrie de masse. Dans le but de purifier le(s) méthyltransférase(s) mycobactérienne(s) responsable(s) de la modification post-traductionnelle de la HBHA, nous avons développé une approche biochimique consistant à réaliser des expériences de fractionnement d'un lysat de M. Bovis BCGΔhbhA sur une série de différentes matrices (échangeuses d'ions, affinité, interactions hydrophobes. . . ) et avons testé l'activité méthyltransférase spécifique de la HBHA dans les fractions obtenues. Ainsi, nous avons pu montrer de façon reproductible que l'activité méthyltransférase est présente dans plusieurs fractions contenant des protéines aux propriétés différentes d'interactions avec les matrices utilisées, ce qui suggère fortement que l'activité méthyltransférase responsable de la modification post-traductionnelle de la HBHA serait en fait le résultat de l'activité de plusieurs enzymes ou de plusieurs isotypes d'une même enzyme. Il n'a pour l'instant pas été possible, même après plusieurs étapes de chromatographie, d'obtenir une fraction assez enrichie pour pouvoir identifier par spectrométrie de masse l'une de ces enzymes ou isotypes. Ces résultats semblent indiquer que les enzymes recherchées sont extrêmement minoritaires au sein de la bactérie. Nous avons également testé l'antigénicité de la HBHA recombinante méthylée in vitro (mrHBHA) par un lysat de BCGΔhbhA. Après caractérisation par spectrométrie de masse du nombre de groupements méthyles portés par cette protéine (mrHBHA), nous avons évalué par méthode ELISA la présence d'anticorps dirigés contre cette protéine dans différents sera murins (souris immunisées par la HBHA native ou le BCG, et/ou infectées par M. Tuberculosis) et humains (primo-infectés ou en phase active de la maladie). Nous l'avons comparée avec la réponse obtenue contre la HBHA recombinante (non méthylée), la HBHA native (méthylée) et les formes recombinante et méthylée in vitro d'une protéine hétérologue sur laquelle est greffé le domaine C-terminal de la HBHA.


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Informations

  • Détails : 1 vol. (168 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 153-168

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  • Bibliothèque : Université du droit et de la santé. Service Commun de la Documentation. BU Santé - Learning center.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 50.379-2006-60-C
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