Immunothérapie anti-tumorale par vecteur bactérien vivant : utlisation du système de sécrétion de type III de pseudomonas aeruginosa

par Olivier Épaulard

Thèse de doctorat en Virologie, microbiologie, immunologie

Sous la direction de Bertrand Toussaint.

Soutenue en 2006

à Grenoble 1 .


  • Résumé

    Le système de sécrétion de type III (SSTT) de P. Aeruginosa est un facteur de virulence permettant à la bactérie d'injecter des toxines directement dans le cytoplasme de cellules-cibles. Nous avons étudié l'utilisation de ce système comme mode de délivrance d'antigène non bactérien aux cellules présentatrices d'antigène (dont les cellules dendritiques)(CD), dans le but de déclencher une réaction lymphocytaire T cytotoxique spécifique. En effet, un vecteur basé sur le SSTT devrait déclencher à la fois l'activation des CD du fait de la nature bactérienne du vecteur, et la présentation par les molécules de classe 1 du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH-I) du fait de la topographie de délivrance de l'antigène. Nous avons utilisé une souche de P. Aeruginosa dont les gènes des toxines du SSTT avaient fait l'objet d'une délétion. La sécrétion des antigènes d'intérêt a été obtenue par fusion transcriptionnelle de la séquence de l'antigène avec celle de la région N-terminale (non toxique) d'un effecteur du SSTT, ExoS. Des souches contrôles produisant l'antigène sans le sécréter ou incapables de le délivrer en intracellulaire ont également été élaborées. Ln vitro en modèle murin, l'interaction de CD avec la souche délivrant l'ovalbumine permet l'activation subséquente d'un clone lymphocytaire T CD8+ spécifique de l'ovalbumine par les CD. Ln vivo, l'injection sous-cutanée de la même souche est associée à la génération de lymphocytes T CD8+ anti-ovalbumine (la réaction humorale contre l'antigène vectorialisé apparaissant minime) ; et les animaux ayant reçu 2 injections sous-cutanées de cette même souche sont résistants à l'implantation d'une tumeur exprimant l'ovalbumine, le mélanome syngénique B 16OV A. Chacun de ces évènements est dépendant de la délivrance de l'antigène par le SSTT. Dans un modèle tumoral in vivo utilisant une tumeur non modifiée (le glioblastome syngénique GL26) et des antigènes tumoraux natifs (gplOO et Trp2), l'injection du vecteur délivrant la gp 100 permet une protection relative contre l'implantation de la tumeur en sous-cutanée. Lors de l'implantation intracérébrale de la tumeur GL26, la survie n'est pas modifiée; des expériences d'immunohistochimie sont en cours pour rechercher des stigmates de réaction lymphocytaire T locale. Ln vitro en modèle humain, l'interaction de cellules dendritiques avec la souche délivrant la protéine Ml du virus Influenza permet l'activation de lymphocytes T CD8+ anti-Ml. Par ailleurs, des mutants atténués (auxotrophisme pour les acides aminés aromatiques, délétion des gènes du quorum sensing) ont été élaborés afin de disposer de vecteurs à l'innocuité maximale. Ce travail fait donc la preuve du concept de l'utilisation de vecteurs bactériens vivants basés sur le SSTT en immunothérapie anti-tumorale.

  • Titre traduit

    Live bacterial vector-based anti-tumor immunotherapy : use of pseudomonas aeruginosa type III secretion system


  • Résumé

    Pseudomonas aeruginosa type III secretion system (TTSS) is a virulence factor allowing direct translocation of bacterial toxins from bacteria to eukaryotic cell cytoplasm. We took advantage of TTSS to elaborate a system of non-bacterial antigen delivery to antigen-presenting cells (among them dendritic cells (DCs)) to trigger a specifie CD8+ T lymphocyte response. Indeed, a TTSS-based vector may allow 1) DCs activation (being a bacteria) and 2) major histocompatibility complex class 1 (MHC-I)-restricted antigen presentation by DCs (because of the intracytoplasmic antigen delivery). We used a P. Aeruginosa strain which TTSS toxin genes had been deleted. Antigen secretion was obtained by transcriptionnal fusion of antigen coding sequence with the TTSS effector ExoS N-terminal (non-toxic) coding sequence. TTSS negative control (producing but not delivering antigen or secreting but not translocating the antigen) were elaborated. Ln an in vitro murine model, interaction of DCs with ovalbumin-delivering vector allows DC activation and CMH-I restricted presentation by DCs of peptide originating from ovalbumin. Ln an in vivo murine model, subcutaneous injection of ovalbumin-delivering vector was associated with an elevation of splenic antiovalbumin CD8+ T lymphocytes, and a poor (if any) anti-ovalbumin antibody generation. After two injections of this vector, animais were highly resistant to a challenge with the ovalbumin-expressing melanoma 816OVA in prophylactic and curative assays. These results were not obtained using TTSS negative controls. Ln an unmodified tumor (glioblastoma GL26) murine model, injection of vector delivering GL26 spontaneous antigen (gp100 and Trp2) was associated with a partial protection against subcutaneous GL26 challenge (with gp100) but not against intracerebral GL26 challenge. Immunohistochemistry is currently performed to assess local CD8+ T lymphocyte tumoral infiltration. Ln a human in vitro model, a vector delivering Influenza virus protein M1 induces the activation by DCs of anti-M1 CD8+ T lymphocytes. Moreover, attenuated vectors (auxotrophic for aromatic aminoacids and/or lacking key quorum sensing genes) have been elaborated. This work demonstrates that TTSS-based vectors may be considered as useful in anti-tumor immunotherapy.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (164 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 149-163

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  • Bibliothèque : Université Grenoble Alpes (Saint-Martin d'Hères, Isère). Bibliothèques et Appui à la Science Ouverte. Bibliothèque universitaire Joseph-Fourier.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : TS06/GRE1/0146
  • Bibliothèque : Université Grenoble Alpes (Saint-Martin d'Hères, Isère). Bibliothèques et Appui à la Science Ouverte. Bibliothèque universitaire Joseph-Fourier.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TS06/GRE1/0146/D
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