Nouvelles sondes nucléiques pour la mesure d'activités enzymatiques de réparation des dommages de l'ADN par un test de fluorescence

par Alexia Chollat-Namy

Thèse de doctorat en Biochimie, biotechnologie santé et management

Sous la direction de Didier Gasparutto et de Alain Favier.

Soutenue en 2006

à l'Université Joseph Fourier (Grenoble) .


  • Résumé

    Les methodes classiques disponibles pour mesurer l'activite enzymatique de reparation des lesions de l'adn par des adn n-glycosylases sont longues et laborieuses a mettre en Œuvre (analyse par electrophorese sur gel couplee au marquage par un isotope radioactif ou encore par chromatographie liquide haute performance). Nous avons developpe dans le present travail, une nouvelle methode de quantification precise et aisee des activites de reparation basee sur une detection utilisant le principe physique du fret (transfert par resonance d'energie de fluorescence). Pour ce faire, un substrat d'adn original a ete conÇu : une structure autocomplementaire contenant des lesions specifiques dans la sequence double brin de l'epingle a cheveux et, ayant les deux extremites marquees par des chromophores. L'excision de la lesion par des adn n-glycosylases conduit a la separation des brins complementaires, induisant une diminution du processus de « quenching » de fluorescence. L'excision est donc detectee et quantifiee par l'augmentation de l'intensite du signal d'emission du fluorophore. Apres avoir etabli la linearite de la reponse du test, nous avons utilise cette approche experimentale pour acceder aux parametres cinetiques caracteristiques des enzymes de reparation. La validite de ces parametres a ete controlee par comparaison avec les donnees obtenues par analyse sur gel d'acrylamide (egpa). Les possibles applications de notre test en tant qu'outil de screening pour la detection d'activite de reparation ou d'inhibition enzymatique, sur enzymes purifiees ou a partir d'extraits cellulaires ont ete investiguees. Enfin, un projet de miniaturisation du format de lecture dans un microsysteme de type « lab-on-a-chip » a ete mene. L'ensemble des resultats obtenus prouve la pertinence de notre methode d'analyse en phase homogene, en vue d'extensions a l'analyse parallelisee haut debit pour des applications en recherche fondamentale, biomedicale et pharmaceutique.


  • Pas de résumé disponible.

  • Titre traduit

    New nucleic acid probes to analyze enzymatic DNA repair activities by a fret assay


  • Résumé

    Classical analysis methods for enzymatic dna repair activity monitoring are tedious and time-consuming (gel electrophoresis coupled to isotope labeling or high performance liquid chromatography). Hence, we developed a new dna repair assay based on fret (fluorescent resonance energy transfer) detection. This has required the design of an original dna probe: a hairpin structure containing specific lesions located at defined sites within the stem sequence, close to the chromophore-labeled extremities. The lesion excision by dna n-glycosylases leads to the complementary strand separation, causing a drop in fluorescence quenching. Thus, the cleavage extent is reflected by the fluorophore emission intensity increase and stabilization over the repair reaction time-course. After proving the linearity of the assay response, we demonstrated the ability of the current method to give access to repair enzyme kinetic parameters. The relevance of these parameters was checked by comparison to values, obtained by page analyses. Then, we investigated the capability of our test to be used as a high-throughput screening tool to quantify enzymatic repair activities and check inhibition effects (by using purified enzymes or cell extracts). Finally, a miniaturization project was carried out to improve the sensitivity of this new detection method. The performance of this homogeneous liquid-phase assay should lead to applications in the bioanalytical field related to fundamental, biomedical and pharmaceutical research.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (249 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. en fin de chapitres

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  • Bibliothèque : Service interétablissements de Documentation (Saint-Martin d'Hères, Isère). Bibliothèque universitaire de Sciences.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : TS06/GRE1/0131
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  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TS06/GRE1/0131/D
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