Vectorisation de gene à l'aide de pseudo-particules virales de papillomavirus humain de type 16 : application au ciblage du transfert de gene vers les cellules pulmonaires et au développement de vecteurs moins immunogènes

par Guillaume Carpentier

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Pierre Coursaget.

Soutenue en 2005

à Tours .


  • Résumé

    Virus like particles (VLP) of human papillomavirus type 16 (HPV-16) are gene transfer vectors. We have developped a targeting system by inserting an Fc-binding motif (ZZ domain) on the viral capsid and coupling the VLP-ZZ to cells with a monoclonal antibody. Two targeting models using human epithelial pulmonary cells as target cells were used to test the VLP-ZZ vector. No gene transfer was observed with the targeted cells. One of the insertions prevents the binding of VLP to heparan sulfates, which are the primary receptor of human papillomaviruses. The decrease in antigenicity of the HPV VLP was also studied. We have further characterized neutralizing epitopes present on the surface exposed FG loop of the HPV-16 and HPV-31 L1 major capsid protein using monoclonal antibody and HPV VLP mutants. Results confirmed the involvment of the EG loop in both type-specific neutralizing epitopes and cross-reactive conformational epitopes.

  • Titre traduit

    Gene transfer using human papillomavirus 16-like particles : targeting the gene transfer to pulmonary cells and developpement of less immunogenic vectors


  • Résumé

    La thérapie génique représente une des approches thérapeutiques de la mucoviscidose mais son efficacité n'a pu être démontrée lors d'essais cliniques. Les vecteurs de gènes employés au cours de ces essais sont soit des vecteurs viraux fortement immunogènes et au tropisme cellulaire plus ou moins restreint, soit des vecteurs synthétiques non-viraux caractérisés par une faible efficacité de transfert de gène et un large tropisme cellulaire. Une alternative à ces deux classes de vecteur est l'utilisation de pseudo-capsides virales (VLP). Mes travaux de thèse ont porté sur le développement d'un système de ciblage des VLP de papillomavirus humain de type 16 (HPV-16) à l'aide d'anticorps spécifiques de différentes lignées de cellules épithéliales pulmonaires, et à l'établissement de vecteurs moins immunogènes par identification des épitopes de la capside virale induisant la production d'anticorps neutralisants. Le système de ciblage que nous avons développé repose sur la fixation d'un anticorps de ciblage sur des VLP présentant un dimère du motif Z issu de la protéine A de Staphylococcus aureus. Ce domaine ZZ est capable de fixer le fragment Fc des immunoglobulines de type G des mammifères. Après construction et production des VLP-ZZ, nous avons testé à l'aide de deux modèles le système de ciblage du transfert de gène vers des lignées de cellules épithéliales pulmonaires humaines. Le transfert de gène n'a pas été détecté dans les lignées de cellules ciblées. L'étude des propriétés de vectorisation des VLP-ZZ a montré que l'une des insertions réalisées altérait la capacité de fixation des VLP-ZZ aux héparanes sulfates, récepteurs primaires des papillomavirus humains. Les travaux de réduction de l'immunogénicité des VLP d'HPV-16 ont consisté à préciser la localisation de l'épitope majeur neutralisant présent sur la boucle FG de la protéine L1 de l'HPV-16 et de l'HPV-31. Pour cela, nous avons utilisé 2 mutants possédant un épitope de la nucléocapside du virus de l'hépatite B (HBc) inséré dans la boucle FG et construit 3 mutants avec substitution de 6 acides aminés de la boucle FG par l'épitope de l'HBc. Nous avons également construit trois mutants ponctuels de la boucle FG. Toutes les protéines L1 chimériques conservent leur capacité d'auto-assemblage en VLP à l'exception du mutant de substitution L1 HBc 274-279. La fixation de 6 anticorps monoclonaux, dont 3 sont neutralisants, a ensuite été testée sur ces sept mutants de VLP. L'étude de la fixation des anticorps conformationnels neutralisants H16. V5 et H16. E70 confirme que la boucle FG contient, ou est impliquée dans la structure des épitopes conformationnels neutralisants. Nous avons également observé que seule l'insertion de l'épitope HBc en 266/267 réduit la fixation de l'anticorps conformationnel neutralisant et cross-réactif H31. F7. Ces résultats suggèrent que l'épitope conformationnel neutralisant reconnu par l'anticorps H31. F7 est situé avant la région 266-271. Nous avons également mis en évidence une réduction de la fixation de H16. E70 sur les VLP dont l'asparagine en 270 est substituée par une alanine, suggérant que l'asparagine en 270 appartient à l'épitope reconnu par cet anticorps. Ces informations contribuent à l'établissement de la structure antigénique des VLP des HPV de types 16 et 31, confirmant la localisation des épitopes neutralisants sur la boucle FG et suggérant l'existence sur cette boucle d'épitopes conformationnels dont certains sont spécifiques de type et d'autres cross-réactifs. Ces résultats vont permettre la construction de vecteurs papillomavirus moins immunogènes.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (125-26 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 108-125. Liste des publications de l'auteur.

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université François Rabelais. Service commun de la documentation. Section Sciences-Pharmacie.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TPH-2005-TOUR-3801
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