Développement de rapporteurs de repliement et de solubilité des protéines basés sur la GFP : application à la définition de domaines solubles de la polykétide synthase Pks13 de Mycobacterium tuberculosis

par Stéphanie Cabantous

Thèse de doctorat en Biochimie. Biologie moléculaire

Sous la direction de Geoffrey S. Waldo et de Lionel Mourey.

Soutenue en 2005

à Toulouse 3 .


  • Résumé

    Ce travail décrit le développement de rapporteurs de repliement et de solubilité des protéines basés sur la GFP. La première technologie " GFP insertion folding reporter " consiste à insérer les protéines au sein de la GFP afin de discriminer des artefacts pouvant apparaître lors de l'évolution moléculaire. La combinaison de ce rapporteur avec la " GFP superfolder " a conduit à la création de rapporteurs chimères permettant une détection plus sensible du repliement des protéines. La deuxième technologie porte sur la conception d'un rapporteur de solubilité basé sur la complémentation de fragments de GFP. Une étiquette GFP est fusionnée à la protéine d'intérêt pouvant être détectée par complémentation avec le fragment de GFP complémentaire. Le système " split-GFP " permet de quantifier in vitro et in vivo l'expression et la solubilité des protéines. La combinaison des technologies " GFP-insertion " et " split-GFP " constitue une " boîte à outils " permettant d'augmenter la fraction soluble de variants protéiques. Enfin, un système de sélection de cadres de lecture a été combiné avec la technologie " split-GFP " pour isoler des domaines solubles de la polykétide synthase Pks13 de Mycobacterium tuberculosis.

  • Titre traduit

    Development of GFP-based folding and solubility reporters : application to the definition of soluble domains of polyketide synthase Pks13 from Mycobacterium tuberculosis


  • Résumé

    This work describes the development of folding and solubility reporters based on GFP. The first technology, the GFP insertion folding reporter, is a modification of the C-terminal GFP folding reporter assay. Guest proteins are inserted inside the GFP scaffolding such that ribosome binding sites appearing during molecular evolution are discriminated. Several insertion GFP reporters with increasing sensitivity to test protein misfolding were created based on chimeras of folding reporter and superfolder GFP. The second technology is a solubility reporter based on engineered self-complementing fragments of GFP. The target protein is tagged with a small fragment of GFP, which is subsequently detected by complementation with the large fragment of GFP. The split GFP complementation system is suitable for both in vitro and in vivo protein solubility and expression screening. The folding and solubility reporter “toolbox” is applied to increase the soluble expression yield of normally-insoluble proteins. The second example illustrates how a novel open reading frame selector can be combined with the split GFP technology to trap soluble domains of a polyketide synthase Pks13 from Mycobacterium tuberculosis.

Consulter en bibliothèque

La version de soutenance existe sous forme papier

Informations

  • Détails : 1 vol. ( 247 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 233-245

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université Paul Sabatier. Bibliothèque universitaire de sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 2005TOU30075
Voir dans le Sudoc, catalogue collectif des bibliothèques de l'enseignement supérieur et de la recherche.