Etude d'une nouvelle classe d'inhibiteurs de la rétrotranscriptase et de l'intégrase du virus de l'immunodéficience humaine de type (VIH-1)

par Joël Didierjean

Thèse de doctorat en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Roland Marquet.

Soutenue en 2005

à Strasbourg 1 .


  • Résumé

    L'Organisation Mondiale de la Santé estime que le VIH-1 est porté par 40 millions de personnes à travers le monde, et qu'il a causé 3,1 millions de décès et 4,9 millions de nouvelles infections au cours de l'année 2004. Les traitements actuels ciblent principalement la rétrotranscriptase du VIH-1 (RT), qui catalyse le passage de l'ARN viral génomique en ADN double brin, substrat de l'intégrase virale (IN). Les antiviraux dirigés contre la RT et utilisés en the��rapie sont soit des terminateurs de chaîne analogues de nucléosides (NRTIs), soit des inhibiteurs non-nucléosidiques (NNRTIs) qui se fixent au niveau d'une poche hydrophobe, à proximité du site de fixation des nucléotides. Dans le cadre du développement de nouveaux inhibiteurs de la RT, nous nous sommes intéressés aux 3,7-dihydroxytropolones (3,7-DHT), qui inhibent l'inositol monophosphatase humaine par chélation de deux ions Mg2+ catalytiques distants de 3,7Å. Or les sites catalytiques polymérase et RNase H de la RT contiennent respectivement deux ions Mg2+ distants de 3,57 et 4Å. En outre, l'IN du VIH-1 possède une plate-forme catalytique proche de celle du site RNase H. Nous avons ainsi entrepris d'étudier l'effet des 3,7-DHT sur les activités de la RT et de l'IN du VIH-1. Nous avons observé une inhibition spécifique de l'une ou l'autre activité de la RT par certaines 3,7-DHT. Des études enzymatiques ont ensuite montré que l'inhibition de l'activité ADN polymérase est non-compétitive vis-à-vis des nucléotides, à l'instar des NNRTIs. Néanmoins, l'étude de RT résistante ou dépourvue du site de fixation des NNRTIs permet d'exclure un mode d'action identique à cette classe d'inhibiteurs. Des expériences de gel-filtration, permettant de suivre l'état d'oligomérisation de la forme active de la RT, hétérodimérique, montrent que les 3,7-DHT ne sont pas capables de la dissocier. L'inhibition des activités de la RT par liaison des 3,7-DHT aux acides nucléiques a été écartée, entre autres, par des expériences de fluorescence. Enfin nous avons montré que les 3,7-DHT n'inhibent pas la polymérisation lors de l'étape de translocation. En revanche, une forte baisse de l'inhibition de la synthèse d'ADN a été mise en évidence lorsque la concentration en Mg2+ diminue, ce qui suggère que les 3,7-DHT ne lient le site actif polymérase qu'en présence des ions Mg2+. L'implication des cations catalytiques dans les mécanismes d'inhibition par les 3,7-DHT a également été étayée par l'observation d'une inhibition des activités de " processing " et de transfert de l'IN, dépendante du cation utilisé. Malheureusement, des cultures cellulaires en présence de 3,7-DHT ont révélé une cytotoxicité importante. Ce résultat était partiellement prévisible, compte tenu de l'existence de nombreuses enzymes bimétalliques cellulaires et de l'utilisation de 3,7-DHT de première génération. Dans l'objectif d'améliorer ces composés, sur la base de leur relation structure/activité, nous avions également pour projet d'obtenir la structure cristallographique d'un complexe ternaire RT/(matrice/amorce)/dNTP, en présence d'une 3,7-DHT. Des cristaux de différents complexes ont été obtenus, mais n'ont pas permis d'obtenir de clichés de diffraction aux rayons X et restent par conséquent à améliorer. Nous avons également étudié l'influence de la concentration en Mg2+ libre sur les activités catalytiques de la RT du VIH-1. En résumé, les résultats obtenus au cours de mon travail de thèse permettent d'élaborer les prémices d'une stratégie de conception " rationalisée " d'inhibiteurs de la RT et de l'IN, dans l'objectif d'obtenir des composés plus spécifiques et plus affins de l'un ou l'autre site catalytique.

  • Titre traduit

    Study of a new class of human immunodeficiency virus type (HIV-1) reverse transcriptase and integrase inhibitors


  • Résumé

    In order to develop new HIV-1 reverse transcriptase (RT) inhibitors, we studied the 3,7-dihydroxytropolones (3,7-DHT) which are known to inhibit the human inositol monophosphatase by chelating the 2 catalytic Mg2+ ions separated from 3,7Å. The HIV-1 polymerase and RNase H catalytic sites contain two Mg2+ ions, distant from de 3,57 and 4Å, respectively. Moreover, the HIV-1 integrase (IN) possesses a catalytic platform similar to the RNase H active site. Therefore, we decided to study the 3,7-DHT on the HIV-1 RT and IN activities. We observed a specific inhibition by some 3,7-DHT derivatives for each RT activity. We showed that the inhibition of the polymerase activity is non-competitive in regard to the dNTP, like non-nucleoside RT inhibitors (NNRTIs). Nevertheless, 3,7-DHT bind neither in the NNRTIs site, nor to the nucleic acids that are substrates of RT activities. Furthermore, 3,7-DHT are not able to induce the dissociation of the heterodimeric form of the active RT. Finally, we showed that 3,7-DHT do not inhibit the polymerization at the translocation step. The implication of the catalytic cations into the mechanisms of RT and IN inhibition by 3,7-DHT has also been studied. In order to increase the 3,7-DHT efficacy and affinity, and to decrease their cytotoxicity, we wanted to get the cristallographic struture of the RT/(primer/template)/dNTP ternary complex with a 3,7-DHT. Cristals from different complex have been obtained, but need to be improved. Taken together these results allow the development of a rationalized design of RT and IN inhibitors, in order to get more specific and efficient compounds of one or another activity.

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Cette thèse a donné lieu à une publication en 2007 par [CCSD] [diffusion/distribution] à Villeurbanne

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  • Détails : 1 vol. (287 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Notes bibliogr.

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  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2005;4919
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