Aspects fonctionnels et structuraux de la régulation de l'expression d'une aminoacyl-ARNt synthétase eucaryote : l'aspartyl-ARNt synthétase de Saccharomyces cerevisiae

par Michaël Ryckelynck

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire

Sous la direction de Richard Giegé.

Soutenue en 2005

à Strasbourg 1 .


  • Résumé

    L'aminoacylation spécifique des ARN de transfert (ARNt) par l'acide aminé homologue est catalysée par les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS). L'aspartyl-ARNt synthétase (AspRS) de Saccharomyces cerevisiae reconnaît spécifiquement, non seulement l'ARNtAsp, mais également son propre ARN messager (ARNmAspRS). Le complexe formé entre l'AspRS et son ARNmAspRS est l'étape initiale du mécanisme de rétro-régulation de l'expression de l'AspRS. Celle-ci est caractérise��e par trois originalités, (i) L'AspRS est présente dans le noyau, (ii) c'est une régulation transcriptionnelle médiée par l'interaction de l'AspRS avec son propre ARNm et (iii) elle implique une coordination de l'expression de l'AspRS avec la concentration cellulaire en ARNt. L'interaction AspRS/ARNmAspRS a été caractérisée au niveau structural par cartographie en solution. Les régions d'ARNm reconnues par l'AspRS ont été identifiées au moyen d'expériences d'empreinte et de mutagenèse dirigée. La structure secondaire est originale à plusieurs égards : (i) elle s'organise en deux domaines indépendants ; (ii) chacun est reconnu par un monomère de l'enzyme ; (iii) un des domaines mime la branche anticodon de l'ARNtAsp avec un triplet anticodon GUC. Les conséquences physiologiques induites par une augmentation de la concentration en AspRS ont été également abordées. In vitro, l'aspartylation de l'ensemble des ARNt de levure en présence de concentrations croissantes en enzyme a montré que l'AspRS aspartyle de façon incorrecte l'ARNtGlu et l'ARNtAsn. In vivo, la construction d'un gène rapporteur conférant à la levure une résistance à la généticine n'a pas permis de détecter cette aspartylation incorrecte, en revanche, le suivi du protéome de la levure lorsque l'AspRS est surexprimée a établi les conditions d'accumulation de l'AspRS dans la cellule suggérant l'existence d'un verrou supplémentaire pour contenir l'aspartylation et assurer la survie de la cellule.

  • Titre traduit

    Functional and structural features of the regulation of a eukaryotic aminoacyl-tRNA synthetase : the case of Saccharomyces cerevisiae aspartyl-tRNA synthetase


  • Résumé

    Accurate translation of genetic information necessitates the tuned expression of a large group of genes. Amongst them, controlled expression of the enzymes catalyzing the aminoacylation of tRNAs, the aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS), is essential to insure translational fidelity. Here, it is shown that expression of AspRS is regulated in Saccharomyces cerevisiae by a feedback mechanism, that necessitates the binding of AspRS to its messenger RNA. The correlation between AspRS expression and mRNAAspRS and tRNAAsp concentrations, as well as the presence of AspRS in the nucleus, suggest an original regulation mechanism. It is proposed that the surplus of AspRS, not sequestered by tRNAAsp, is imported in the nucleus where it binds to mRNAAspRS and thus inhibits its accumulation. We have established the folding of the 300-nucleotides long 5' end of mRNAApRS and identified the structural signals involved in the regulation process. We propose that the mRNAAspRS fragment folds in two independent and symmetrically structured domains spaced by two single-stranded connectors. Domain I displays a tRNAAsp anticodon-like stem-loop structure that is restricted in domain II to a short double-stranded helix. The overall mRNA structure, based on enzymatic and chemical probing, support a model where each monomer of yeast AspRS binds one individual domain and recognizes the mRNA structure like it recognizes its cognate tRNAAsp. Finally, the consequences of an increased concentration of AspRS in the cell have been tested. In vitro, high AspRS concentrations lead to mis-aspartylation of tRNAAsn and tRNAGlu. In vivo, the design of a reporter gene conferring an antibiotic resistance, dependent on mischarged tRNAs, did not allow to detect any cross aminoacylation. However, the proteomic analysis of yeasts overexpressing AspRS pointed out the conditions of AspRS accumulation in the cell by detecting the presence of an additional control mechanism at the post-translational level.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (233 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p.217-233

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  • Bibliothèque : Université de Strasbourg. Service commun de la documentation. Bibliothèque Danièle Huet-Weiller.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2005;4905
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