Développement de nouveaux complexes métalliques pour le marquage spécifique des protéines étiquetées

par Marie Brellier

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Charles Mioskowski.

Soutenue en 2005

à l'Université Louis Pasteur (Strasbourg) .


  • Résumé

    'étude des interactions protéine-protéine a engendré ces dernières années un intérêt accru pour les méthodes de marquage chimique et biologique des protéines. Les travaux décrits portent sur le développement d'une nouvelle stratégie conduisant à un marquage spécifique et régiosélectif des protéines étiquetées par une séquence peptidique. Le succès de cette méthode reposant sur la formation d'un complexe métallique stable entre l'étiquette peptidique de la protéine et la sonde chimique, nous avons recherché des systèmes étiquette-métal-ligand les plus stables possible. Pour cela, un test de criblage haut-débit, basé sur des mesures de polarisation de fluorescence, a été mis au point. Parmi les divers ligands testés, plusieurs candidats potentiels ont été sélectionnés, notamment un composé phosphoré ainsi que diverses structures bisNTA. La fonctionnalisation des meilleurs candidats par la fluorescéine et par le BODIPY, dont une synthèse économique et originale a été mise au point, a permis l'évaluation quantitative des gains d'affinité engendrés. Parallèlement, l'étude calorimétrique des couples nickel/bisNTA et nickel/polyhistidine a permis de mettre en évidence, pour la première fois, la particularité de leur mode de chélation respectif. L'étude approfondie des polyhistidines nous a, en outre, conduit à considérer l'hexapeptide comme la sonde la plus stable pour notre stratégie. Dans le dernier chapitre, nous avons procédé au verrouillage covalent du complexe ternaire en conditions oxydantes. Les premiers résultats indiquent la formation d'un marquage covalent, spécifique et régiosélectif de l'étiquette de la protéine cible par la sonde peptidique His6-Tyr. Les différents résultats obtenus permettent, d'ores et déjà, d'envisager une multitude d'applications biologiques in vitro. Le criblage d'une librairie de ligands plus large devrait, en outre, permettre d'isoler des complexes ternaires plus stables en vue d'applications in vivo.

  • Titre traduit

    Development of new metallic complexes for the specific tagged-protein labeling


  • Résumé

    The study of protein-protein interactions has lead, in the past ten years, to an increasing interest for the development of biological and chemical methods of protein labeling. The research work herein described, focuses on the development of a new strategy for the specific and regioselective labeling of tagged-proteins. Since the efficiency of this method relies on the formation of a very stable ternary metallic complex between the peptidic tag and the metallo-organic probe, we intended to discover new ternary systems “tag-metal-ligand” of high stability. In this purpose, we first had to set up an innovative high-throughput screening assay based on fluorescence polarisation measurements to evaluate the best partners for this study. Among the diverse ligands tested, two families of compounds turned out to be potential good candidates : phosphonate derivatives and bisNTA types of structures. To evaluate their stability enhancement in a quantitative fashion, the best candidates were functionalized with various fluorophores such as fluorescein and the BODIPY group. In the meanwhile, an original and efficient strategy for the synthesis of Bodipy compounds were developed. Additional calorimetric studies of the nickel/bisNTA and nickel/polyhistidine pairs were performed to light on their particular chelating behaviour. The full understandings of the polyhistidine/nickel interaction lead us to consider the peptide as our most efficient probe. The last chapter proceeds with the development of a covalent locking of the ternary complex under oxidative conditions. The first results are very encouraging and clearly show the formation of a covalent, specific and regioselective labeling of the tag by the His6-Tyr peptidic probe. Given these successful results, we can envision, from now on, several biological in vitro applications. In vivo applications would probably require the screening of a larger library of ligands aiming at identifying more stable ternary complexes.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (373 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Notes bibliogr.

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  • Bibliothèque : Université de Strasbourg. Service commun de la documentation. Bibliothèque Blaise Pascal.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : Th.Strbg.Sc.2005;4809
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