Transfection de l'épithélium respiratoire nasal normal de souris

par Jérôme Lemoine

Thèse de doctorat en Pharmacie. Biologie cellulaire et moléculaire

Sous la direction de Bernard Desoize.

Soutenue en 2005

à Reims .


  • Résumé

    La @mucoviscidose est une maladie génétique affectant principalement les poumons, qui est due à la mutation du gène CFTR. La protéine CFTR est un canal chlorique. Le transfert du gène CFTR sauvage dans l'épithélium bronchique peut être obtenu à l'aide de vecteurs de gènes non-viraux. Ces transferts n'ont pas permis, jusqu'à présent, de corriger complètement le transport de chlorure. Dans cette étude, nous avons démontré que de l'ADN nu dissout dans de l'eau déminéralisée transfecte les cellules épithéliales nasales plus efficacement que dans une solution isotonique ou hypertonique. Cette méthode a été baptisée : transfection par choc hypotonique. Le plasmide serait internalisé par les cellules épithéliales au cours de l'étape dite de diminution régulée du volume cellulaire du choc hypotonique. La stratégie la plus simple pour améliorer la transfection a consisté à raccourcir le plasmide, en le coupant dans la portion bactérienne à l'aide d'enzymes de restriction. L'expression du transgène obtenue suite à l'administration de fragments d'ADN nu, dissous dans de l'eau pure, a atteint un très haut niveau. L'amplificateur transcriptionnel IE1 du CMV contient des sites de fixation pour NF-κB et ATF-CREB, qui ont été remplacés par des sites Oct-1. Les sites de fixation non-consensuels NF1 et Sp1, ont été remplacés par leurs homologues consensuels. Ces modifications ont permis de réduire la diminution de l'expression du transgène entre les jours un et dix. La thérapie génique de la mucoviscidose deviendra concevable s'il est possible d'atteindre et de maintenir pendant plusieurs semaines, un niveau élevé d'expression du transgène dans l'épithélium bronchique des patients.


  • Pas de résumé disponible.

  • Titre traduit

    Gene transfer to the mouse normal nasal airway epithelium : zeng


  • Résumé

    @Cystic fibrosis is a recessive genetic disease mostly affecting the lung. It is due to the mutation or the loss of the CFTR gene. The CFTR protein is a chloride channel located in the apical membrane of airway epithelial cells. CFTR gene transfer to the bronchial epithelium might be carried out by nonviral vectors, which appear insufficiently efficient to date. In this study, we have demonstrated that naked DNA dissolved in deionized water transfect the nasal airway epithelial cells 100-fold more efficiently than in an isotonic or hypertonic solution. This method has been named transfection by hypotonic shock. The plasmid DNA would be endocytosed by the airway epithelial cells during the so-called phase of regulatory volume decrease of the hypotonic shock. The simplest strategy to further improve gene transfer consisted in shortening the plasmid DNA by deleting a part of its backbone by using some restriction enzymes. The transgene expression achieved by some naked DNA fragments dissolved in pure water was over 21-fold higher than that obtained by the intact plasmid DNA. The CMV IE1 enhancer contains a few NF-κB and ATF-CREB binding sites, which were replaced by Oct-1 binding sites. Also, the non-consensual NF1 and Sp1 binding sites were replaced by their consensual sequences. These modifications reduced the decline of the transgene expression 3. 4-fold between day 1 and day 10. Gene therapy will become a conceivable therapeutic approach, if a high level of transgene expression is sustained for several weeks in the bronchial epithelium of cystic fibrosis patients.

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Informations

  • Détails : 1 vol.(195 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f.161-195

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  • Bibliothèque : Université de Reims Champagne-Ardenne. Bibliothèque universitaire. Section Santé.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : SATHP05205
  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : MFTH 6677
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