Identification et caractérisation d'une famille de gènes codant pour des protéines ABC tranporteurs chez Toxoplasma gondii

par Virginie Sauvage

Thèse de doctorat en Médecine. Biologie parasitaire

Sous la direction de Jean-Marc Millot et de Dominique Aubert.

Soutenue en 2005

à Reims .


  • Résumé

    La toxoplasmose est une zoonose due à un parasite intracellulaire obligatoire, Toxoplasma gondii. L'infection généralement bénigne peut cependant être responsable de formes cliniques sévères particulièrement en cas de transmission congénitale et chez l'immunodéprimé. Les différents schémas de traitement de la toxoplasmose reposent sur un nombre limité de médicaments et des échecs thérapeutiques ont été rapportés dans le traitement de la toxoplasmose congénitale ou celui des formes graves survenant chez les patients immunodéprimés. L'implication de protéines de transport responsables d'une réduction de l'accumulation des médicaments à l'intérieur du parasite, phénomène décrit chez Plasmodium, pourrait participer à ces échecs. Suite à l'émergence des résistances aux antiparasitaires, de nombreux gènes codant pour des protéines ABC transporteurs de type Pgp (ABCB) et MRP (ABCC) ont été identifiés et caractérisés chez de nombreux parasites protozoaires. Chez T. Gondii, des travaux précédents ont montré que différents inhibiteurs de Pgp, notamment le vérapamil et la cyclosporine A, réduisent l'invasion parasitaire de façon significative. Par conséquent, nous avons étudié le transport actif de xénobiotiques et sa modulation par le vérapamil et la cyclosporine A sur des parasites extra- et intracellulaires. L'utilisation de sondes fluorescentes (JC-1 et Daunorubicine) a permis de montrer, par spectrofluorimétrie et microscopie confocale, une inhibition des échanges moléculaires en présence de ces deux inhibiteurs à la fois dans les parasites vivants extra- et intracellulaires. Ces résultats ont suggéré l'existence d'une P-glycoprotéine homologue localisée au niveau du complexe membranaire du parasite. A la vue de ces résultats, l'identification de protéines de type ABC transporteur chez T. Gondii, a été abordée dans un premier temps par une approche utilisant des amorces dégénérées dirigées contre les motifs consensus, ce qui nous a permis d'isoler une séquence de 393 pb, nommée TgABC1, correspondant au site ATPasique d'une putative protéine ABC dont nous avons vérifié l'expression par RT-PCR au stade tachyzoïte des trois types de souches (I, II, III). En parallèle, nous avons exploré la banque de données de T. Gondii, ToxoDB récemment finalisée. Une recherche par homologies de séquences (Blastp) utilisant les protéines ABC caractérisées chez l'homme et les protozoaires a permis d'identifier 24 0RFs. Quinze d'entre eux ont été classés dans 5 des 7 familles ABC humaines: 6 ABCB, 2 ABCC, 1 ABCE, 1 ABCF et 5 ABCG. Les 9 ORFs restant correspondent à 4 protéines SMC, 4 ABCH et une protéine de structure atypique, non classable. La présence de transcrits ABC a été détectée aux stades tachyzoïte (I, II, III) et bradyzoïte (II, III) pour tous les gènes étudiés, suggérant une implication importante des protéines correspondantes dans la biologie du parasite. Ces gènes pourraient constituer de nouvelles cibles thérapeutiques. A notre connaissance, il s'agit de la première identification d'une famille de gènes codant pour des protéines ABC transporteur chez T. Gondii.


  • Résumé

    @Toxoplasma gondii is a protozoan intracellular parasite responsible for widespread infections. Toxoplasmosis is generally asymptomatic or causes very mild symptoms, but it can be severe in two populations, namely congenitally infected children and immunocompromised patients. Treatments of toxoplasmosis are limited, and failure due to drug resistance were reported in case of congenital or severe toxoplasmosis. One explanation could be due to implication of proteins in transport leading to reduction of drug concentrations into parasite, as described in Plasmodium. Several genes encoding for ABC transporters of Pgp (ABCB) and MRP (ABCC) type, were identified and characterized among protozoan parasites (ie P. Falciparum). In T. Gondii, previous studies showed that different Pgp inhibitors, such as verapamil and cyclosporine A, significantly decreased parasite invasion. Hence, we investigated the active transport of xenobiotics (JC-1 and Daunorubicine; fluorescent probes) and its modulation by verapamil and cyclosporine A on extra- and intracellular parasites. We have observed that these two Pgp inhibitors increase both extracellular and intracellular dye accumulation in living T. Gondii, pointing to the existence of a transmembrane transport mediated by a Pgp homologue localized on the parasite membrane complex. To further this study, degenerate oligonucleotide primers directed against consensus motifs were used in a PCR-based approach to clone a member of the ABC genes in T. Gondii. The isolated nucleotide sequence displayed a 393 bp open reading frame which was named T. Gondii ABC1 gene (TgABC1) corresponding to the ATP-binding site of a putative ABC protein. TgABC1 gene expression was detected by RT-PCR in the tachyzoite stage of T. Gondii genotypes I, II and III. Finally, the recent completion of the T. Gondii genome (ToxoDB) has permitted to retrieve 24 putative ABC proteins by BLAST comparison. For this, we used human and protozoan ABC sequences, and ATP-binding consensus motifs to screen the T. Gondii TwinScan2 predicted proteins database. Fifteen of them clustered into 5 of the 7 families of human ABC proteins: 6 ABCB, 2 ABCC, 1 ABCE, 1 ABCF and 5 ABCG. The 9 remaining ORFs were represented by 4 SMC proteins, 4 ABCH, and 1 member of atypical structure. The presence of ABC transcripts was detected in tachyzoite (I, II, III) and bradyzoite (II, III) stages, for all genes studied. Further research on the implication of these ABC proteins will increase our knowledge of the basic biology of Toxoplasma and provide the opportunity to identify novel therapeutic targets. To our knowledge, this is the first report of ABC protein-encoding genes family in T. Gondii.

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Informations

  • Détails : 1 vol.(121 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f.104-121

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  • Cote : SATHM05207
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  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TH2016-002446
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