Caractérisation moléculaire de la laforine impliquée dans la maladie de Lafora : une protéine phosphatase humaine à double spécificité associée à un domaine de fixation à l'amidon

par Jean-Marie Girard

Thèse de doctorat en Sciences biologiques. Ingénierie des protéines et biologie structurale

Sous la direction de Florence Lederer.

Soutenue en 2005

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des Sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .


  • Résumé

    Certaines mutations dans le gène EPM2A provoquent la maladie de Lafora, une épilepsie myoclonique progressive dont l'issue est fatale, caractérisée par la présence de corps d'inclusion de polyglucosan dans les tissus nerveux. L'analyse de la séquence du produit du gène (laforine) suggère la présence de deux domaines : un site de liaison à l'amidon (CBM20) en N-terminal, identifié pour la première fois dans une protéine humaine et un site catalytique de phosphatase à double spécificité (DSPc) en C-terminal. La partie codante du gène a été clonée a partir d'une banque de cDNA humain. Différentes constructions ont été réalisées et ont permis d'obtenir la laforine pure et soluble. Une première caractérisation a montré que la laforine se liait à l'amidon, conformément aux prédictions, mais également au glycogène. Des expériences de compétition entre ces deux polysaccharides mettent en évidence que la fixation aux sucres est spécifique. L'activité catalytique phosphatase a été mesurée pour deux substrats : le p-nitrophényl phosphate et l'O-méthylfluorescéinyl phosphate (OMFP). Les paramètres cinétiques montrent une meilleure efficacité catalytique vis-à-vis de l'OMFP, indiquant que la laforine porte une fonction de DSP. Ni le glycogène ni de petits saccharides n'affectent la fonction catalytique. Ceci est à comparer aux données sur les MAP kinases phosphatases (MKP) dont le site catalytique est homologue à celui de la laforine mais dont l'activité est régulée par la fixation au substrat. Par conséquent, il apparaît que le rôle du domaine CBM20 de la laforine soit de localiser la protéine au glycogène où elle pourrait jouer un rôle, qui reste à élucider, dans son métabolisme.

  • Titre traduit

    Molecular characterization of laforin, a dual-specificity protein phosphatase implicated in Lafora disease : a human dual specificity phosphatase associated to a starch binding domain


  • Résumé

    Mutations in the EPM2A gene cause Lafora disease, a fatal progressive myoclonus epilepsy characterized by the presence of polyglucosan inclusion bodies in nervous tissues. Sequence analysis of the gene product (laforin), suggested two domains: an N-terminal starch-binding domain (CBM20), found for the first time in a human protein, and a C-terminal dual specificity phosphatase catalytic domain (DSPc). The gene was cloned from human muscle cDNA. Different constructs were assayed to express and purify the laforin which aggregated easily. Adsorption experiments demonstrate that laforin binds granular starch as predicted, and ultracentrifugation studies showed the protein also binds to glycogen. Competition experiments between granular starch with either glycogen or beta-cyclodextrin indicated the binding to be specific. To demonstrate the second predicted function, the catalytic activity was tested with p-nitrophenyl phosphate and O-methylfluorescein phosphate (OMFP), two non physiological substrates. Laforin exhibited a better efficiency toward OMFP, indicating that laforin bears a DSP function. Further experiments showed that neither glycogen nor smaller sugars affected the laforin catalytic activity. This is in contrast with MAP kinases phosphatases (MKP). Indeed, the laforin catalytic domain is homologous to that of MKPs but CBM20 is different from their regulatory domain. For MKPs, the catalytic activity is increased when the regulatory domain binds to their substrates. Thus it appears that the role of the laforin CBM20 domain is to target the protein to glycogen in the cells. In conclusion laforin may play a role in glycogen metabolism which has to be elucidated.

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Informations

  • Détails : 1 vol., 201 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 151-159

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 0g ORSAY(2005)334
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