Etude de l'enzyme MurG impliquée dans les étapes membranaires de la biosynthèse de la paroi bactérienne

par Muriel Crouvoisier

Thèse de doctorat en Sciences biologiques. Biochimie

Sous la direction de Dominique Mengin-Lecreulx.


  • Résumé

    L’uridine diphospho-N-acétylglucosamine:N-acétylmuramyl-(pentapeptide) pyrophosphoryl-undécaprénol N-acétylglucosamine transférase, MurG, est une enzyme essentielle de la voie de biosynthèse du peptidoglycane, une macromolécule majeure de la paroi bactérienne. Cette enzyme catalyse l’une des étapes membranaires de la biosynthèse, à savoir la dernière étape avant la polymérisation du peptidoglycane. Sa présence en faible quantité et sa localisation au niveau de la face interne de la membrane cytoplasmique rendaient l’étude de MurG difficile. La construction de vecteurs de surproduction et la mise au point de techniques d’extraction et de purification ont permis de purifier cette enzyme en quantité suffisante pour son étude biochimique. L’alignement de séquences de protéines MurG de différentes espèces bactériennes a permis de mettre en évidence des motifs fortement conservés, spécifiques des protéines MurG et dans lesquels plusieurs résidus sont totalement invariants. Des expériences de mutagenèse dirigée ont permis de produire des protéines MurG de E. Coli dont l’un des résidus fortement conservés est substitué par une alanine. L’étude des paramètres cinétiques de la forme sauvage et des formes mutées de l’enzyme MurG, et l’étude de l’effet du pH sur ces enzymes ont confirmé l’importance des résidus que nous avons choisi de muter pour l’activité enzymatique. Par ailleurs, la capacité de l’enzyme à catalyser la synthèse de lipide II en présence d’un analogue de l’UDP-N-acétylglucosamine, l’UDP-glucosamine, a été testée;la transférase MurG semble incapable de synthétiser du lipide II à glucosamine alors que seule une fonction N-acétyle la différencie du substrat naturel.

  • Titre traduit

    Study of the MurG transferase involved in membran steps of bacterial cell wall biosynthesis


  • Résumé

    The uridine diphospho-N-acetylglucosamine:N-acetylmuramyl-(pentapeptide) pyrophosporyl-undecaprenol N-acetylglucosamine transferase, MurG, is an essential enzyme of the biosynthesis pathway of peptidoglycan, a major macromolecule of bacterial cell wall. It catalyses one of the two membrane steps from this pathway, the last step before the polymerisation of peptidoglycan. This one is a major macromolecule. The MurG study was difficult owing to its presence in small amounts and its localization at the inner face of the membrane. Vectors were constructed in order to overproduce MurG, and extraction and purification techniques were improved so that MurG could be produced and purified in sufficient enough amount for its biochemical study. The sequence alignment of MurG proteins of different bacterial species allowed the display of highly conserved patterns which are specific to MurG proteins and in which some residues are completely invariant residues. Site-directed mutagenesis experiments allowed the production of E. Coli MurG proteins in which one of the highly conserved residues is changed into alanine. The kinetic parameters study from the wild type and the mutated forms of MurG, and the pH effect on this enzymes confirmed the importance for the MurG activity of the residues that were chosen for mutagenesis. Moreover, the enzyme ability to catalyse lipid II synthesis in presence of an analogue of UDP-N-acetylglucosamine, UDP-glucosamine, was tested; the MurG transferase does not seem to be able to synthesize glucosamine-lipide II although the only difference with the natural substrate is the absence of the N-acetyl group.

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Informations

  • Détails : 137 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 131-137

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 0g ORSAY(2005)1
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