Détection et génotypage des kystes de Giardia lamblia à partir de matrices environnementales et d'échantillons biologiques

par Isabelle Bertrand

Thèse de doctorat en Biologie santé environnement. Chimie et microbiologie de l'eau

Sous la direction de Janine Schwartzbrod.

Soutenue en 2005

à Nancy 1 , en partenariat avec Université de Nancy I. UFR Sciences pharmaceutiques et biologiques (autre partenaire) .


  • Résumé

    Dans les pays industrialisés, les nombreuses épidémies d'origine hydrique dues aux protozoairesont souligné l'importance de ces micro-organismes longtemps sous-estimés par rapport aux bactéries et aux virus. Parmi ces protozoaires, Giardia lamblia est une espèce complexe composée de sept génotypesdont seulement deux sont considérés comme pathogènes pour l'Homme, mais aussi pour de nombreux mammifères. Les méthodes de référence actuelles font appel à l'immunofluorescence qui autorise uniquement la détection de l'ensemble des kystes du genre Giardia. Dans ce contexte, notre étude a pour objectif de développer des outils permettant une détection spécifique des espèces et des génotypes, puis de les transférer à l'analyse d'échantillons environnementaux et biologiques. La première partie de notre étude est réalisée uniquement à partir de kystes en suspensions purifiées. Dans un premier temps, nous avons sélectionné et validé un système de détection par PCR en temps réel permettant d'augmenter la spécificité de détection pour l'espèce Giardia lamblia par rapport à l'immunofluorescence. Au-delà de la mise en évidence de cette espèce, nous avons également mis en place deux PCR en temps réel assurant la détection spécifique des génotypes A et B pathogènes pour l'Homme, ainsi que deux PCR analytiques destinées à la mise en évidence des génotypes C et E spécifiques respectivement d'animaux domestiques et d'élevage. La sensibilité, la spécificité et la rapidité de détection constituent les avantages majeurs de ces différents outils. La deuxième partie de nos travaux vise à transférer ces techniques de détection à l'analyse d'échantillons environnementaux suite à l'évaluation de protocoles de concentration et de purification des kystes. Les techniques basées sur la détection du génome sont en effet sensibles à de nombreux composés inhibiteurs présents à des concentrations élevées dans les échantillons biologiques et surtout environnementaux, et pouvant alors entraîner une sous-estimation de la contamination par ces micro-organismes. Différentes techniques de purification basées sur la densité des éléments à purifier (flottation et gradients de densité), la séparation immunomagnétique (IMS), mais aussi des procédés destinés à limiter l'effet des inhibiteurs de PCR lors de l'extraction des acides nucléiques ou de leur amplification sont évalués au cours de cette étape. Le protocole sélectionné suite à ces expérimentations comporte une concentration par centrifugation suivie par une purification des kystes par séparation diphasique à l'acétate d'éthyle et une flottation sur solution de PercollTM-saccharose (d : 1,10). L'étape d'extraction des acides nucléiques est également modifiée au niveau de la digestion de protéines et de la purification des acides nucléiques. La troisième partie constitue l'étape majeure de notre étude puisqu'elle concerne tout d'abord la détection de l'espèce Giardia lambha suivie par une analyse plus fine au niveau des génotypes. La détection de l'espèce G. Lamblia s'avère alors positive pour l'ensemble des prélèvements. Des disparités sont ensuite mises en évidence pour les génotypes. Le génotype A est ainsi isolé au niveau des stations d'épuration et de l'abattoir, alors que le génotype B, plus rarement mis en évidence, n'est détecté dans aucun échantillon provenant de l'abattoir. La détection du génotype E confirme la différence observée entre ces sites puisqu'il est détecté uniquement dans les eaux usées de l'abattoir et apparaît comme un marqueur potentiel de contamination non-humaine. Les systèmes spécifiques des génotypes A et B ont également permis de génotyper des kystes de Giardia lamblia isolés de selles humaines. Le génotype B apparaît alors comme nettement majoritaire pour l'ensemble des prélèvements quelque soit leur origine. Cette première étude réalisée en France permet de détecter les génotypes B et A dans 64 % et 36 % des cas sporadiques respectivement. L'analyse de cas regroupés aboutit également à la mise en évidence du génotype B. Ces expérimentations démontrent l'intérêt des techniques de biologie moléculaire pour une détection rapide, sensible et spécifique, mais aussi pour le génotypage de ce protozoaire au niveau environnemental et biologique.


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Informations

  • Détails : 1 vol. (229 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Références bibliographiques : p. 213-229

Où se trouve cette thèse\u00a0?

  • Bibliothèque : Université de Lorraine (Vandoeuvre-lès-Nancy, Meurthe-et-Moselle). Direction de la Documentation et de l'Edition - BU Santé.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : T/D/PH/N/2005/9
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