Caractérisation enzymatique de la Méthylmalonate semialdéhyde déshydrogénase de Bacillus subtilis

par Claire Chaumeil-Stines

Thèse de doctorat en Enzymologie moléculaire

Sous la direction de Guy Branlant.

Soutenue en 2005

à Nancy 1 , en partenariat avec Université Henri Poincaré Nancy 1. Faculté des sciences et techniques (autre partenaire) .


  • Résumé

    La méthylmalonate semialdéhyde déshydrogénase (MSDH) de Bacillus subtilis, enzyme homotétramérique, catalyse l'oxydation NAD+-dépendante du méthylmalonate semialdéhyde en propionyl-coenzyme A via un mécanisme à deux étapes. Le mécanisme de la réaction a été étudié. Les résultats montrent que la liaison du NAD entraîne un réarrangement local conformationnel de la MSDH et que la MSDH présente une réactivité de demi-site avec deux sous-unités actives par tétramère. Les résultats montrent également un mécanisme séquentiel d'activation de la Cys 302 catalytique, son pKapp passant de 8. 8 dans l'apoenzyme à 8 dans le complexe binaire et enfin à 5. 5 dans le complexe ternaire. L'étape limitante de la réaction est associée au processus de beta-décarboxylation qui a lieu après le relargage du NADH du complexe ternaire thioacylenzyme et avant l'étape de transthioestérification. La fixation du substrat est stabilisée par l'interaction de son carboxylate avec les résidus invariants R124 et R301.

  • Titre traduit

    Enzymatic characterization of methylmalonate semialdehyde dehydrogenase from Bacillus subtilis


  • Résumé

    Homotetrameric methylmalonate semialdehyde dehydrogenase (MSDH) from Bacillus subtilis catalyzes the NAD+-dependent oxidation of methylmalonate semialdehyde into propionyl-Coenzyme A via a two-step mechanism. A detailed mechanistic characterization of the MSDH-catalyzed reaction has been carried out. The results show that NAD binding elicits a structural imprinting of the apo-enzyme. The enzyme exhibits a half-of-the-site reactivity with two subunits active per tetramer. The results support also a sequential C302 activation process with a pKapp shift from ~ 8. 8 in the apo-form to 8. 0 in the binary complex and finally ~ 5. 5 in the ternary complex. The rate-limiting step is shown to be associated with the beta-decarboxylation process which occurs on the thioacylenzyme intermediate after NADH release and before the transthioesterification step. Binding of the substrate is favoured by stabilizing interactions between its carboxylate group and the invariant residues R124 and R301.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (125 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 111-125

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