Les chimiokines en physiopathologie pulmonaire : rôle de CCL18

par Patricia de Nadaï

Thèse de doctorat en Immunologie

Sous la direction de Anne Tsicopoulos.

Soutenue en 2005

à Lille 2 .


  • Résumé

    Les chimiokines sont un élément essentiel du trafic cellulaire aussi bien homéostatique que dans des situations pathologiques. CCL18 est une chimiokine récemment clonée, exprimée préférentiellement au niveau pulmonaire et induite par les cytokines de type Th2 telle que l'IL-4, l'IL-13 et l'IL-10. Ces données nous ont amenés à étudier l'expression et le rôle de CCL18 dans différentes pathologies pulmonaires. Nous nous sommes tout d'abord intéressés à l'implication de CCL18 dans l'asthme allergique, et sa régulation par différents facteurs. Nos études in vitro nous ont permis de montrer que CCL18 est produite de façon tardive par les cellules mononucléées (CMN) de patients allergiques stimulées par l'allergène, en particulier par les cellules dendritiques plasmacytoïdes et par les monocytes via la sécrétion d'IL-4 et d'IL-13. De plus, CCL18 est capable d'attirer les basophiles et les lymphocytes Th2 mais pas les éosinophiles ni les cellules Th1. Les études ex-vivo ont montré que CCL18 est augmenté au niveau du lavage broncho-alvéolaire de sujets asthmatiques non traités par rapport à des sujets contrôles ou asthmatiques traités par des corticoïdes inhalés. Ces résultats suggèrent un rôle de CCL18 dans la réaction allergique. L'effet de corticoïdes sur l'expression de CCL18 a ensuite été analysé. Les patients asthmatiques traités par des corticoïdes ont des taux circulants multipliés par 2,5. Cependant, les patients atteints de broncho-pneumopathie chronique obstructive ont des taux de CCL18 circulant élevés qui ne sont pas modifiés par les corticoïdes. De même, les patients atteints de mucoviscidose ont des taux de CCL18 circulants normaux qui ne sont pas modifiés par les corticoïdes. Dans cette pathologie, CCL18 est corrélé à l'IL-13 sérique. Ces résultats suggèrent une influence des corticoïdes sur la sécrétion de CCL18, données confirmées par une étude in vitro où la sécrétion de CCL18 induite par les cytokines IL-4 et IL-10 est potentialisée par la dexaméthasone, alors qu'elle inhibe la production induite par le LPS. L'effet de facteurs environnementaux et notamment l'exposition au diesel a été évalué. La stimulation de CMN de patients allergiques par le diesel entraîne une augmentation tardive de la sécrétion de CCL18 avec ou sans costimulation allergénique, suggérant un rôle de cette chimiokine dans l'effet du diesel sur la réaction allergique. Enfin, dans le mésothéliome pleural les taux de CCL18 circulants et pleuraux sont élevés. On y constate un déficit en cellules T au niveau pleural avec de forte concentration d'IL-10 et des cellules T régulatrices par rapport aux lésions pleurales bénignes. De plus, CCL18 pleural est corrélé aux cellules NK infiltrées. La présence au niveau local de types cellulaires anti- et pro- tumoraux nécessite une étude approfondie pour déterminer leur fonctionnalité. L'étude de CCL18 in vivo est limitée par l'absence d'homologue murin. Un modèle de souris immuno-déficientes (SCID) greffée avec de la peau humaine a donc été mis au point dans le but de tester l'effet des chimiokines et de leurs récepteurs in vivo. Dans un premier temps, nous avons évalué dans ce modèle la part du CCR5 dans le recrutement leucocytaire induit par CCL5 (RANTES). CCL5 induit un recrutement significatif de cellules T mémoires, de monocytes/macrophages, d'éosinophiles et de cellules IFN-γ+ mais pas IL-4+ ou IL-5+. L'inhibition du CCR5 entraîne une inhibition complète du recrutement des monocytes/macrophages et des cellules productrices d'IFN-γ, bien qu'elles expriment d'autres récepteurs de CCL5, et n'a pas d'effet sur le recrutement des éosinophiles. Ces résultats suggèrent qu'in vivo l'environnement régule les cibles de CCL5 aboutissant à un recrutement différentiel de cellules. Dans un deuxième temps, nous avons évalué l'effet de CCL18 dans ce modèle, après injection par voie intradermique. Les résultats préliminaires mettent en évidence un recrutement de cellules CD4+CD45RA+, CD4+CD45RO+, CD4+CD25+ et des cellules IL-10+ laissant supposer que, comme in vitro, CCL18 attire les cellules T naïves, mais aussi les mémoires et éventuellement les cellules T régulatrices, ceci restant à confirmer. Le récepteur de CCL18 est encore inconnu, nous nous sommes intéressés au clonage de ce récepteur à l'aide d'une méthode utilisant des molécules produites en cellules eucaryotes. Des vecteurs d'expression de CCL18 et des chimères de CCL18 couplées au fragment Fc de l'IgG1 humaine et murine ont été construits. Ces trois molécules ont été exprimées en cellules eucaryotes CHO et HEK293. Nous nous sommes attachés à mettre au point un système de sécrétion suffisant et une méthode de purification efficace. Ces molécules purifiées serviront ensuite au clonage du récepteur par screening à partir d'une banque d'ADNc.


  • Résumé

    Chemokines are a key factor for cellular traffic in homeostasis or pathological conditions. CCL18 is a chemokine recently cloned, preferentially expressed in lung tissue and induced by Th2-type chemokine like IL-4, IL-13 and IL-10. We studied CCL18 expression and role in different lung pathologies. First, we analysed CCL18 involvement in allergic asthma, and its regulation by several factors. In vitro studies showed that CCL18 was lately produced by mononuclear cells (PBMC) isolated from allergic patients and stimulated by allergen, involving IL-4 and IL-13 production by plasmacytoid dendritic cells and monocytes. CCL18 was able to attract basophiles and Th2 lymphocytes, but not eosinophils and Th1 lymphocytes. Ex vivo studies showed that CCL18 was increased in the bronchoalveolar lavage from non-treated asthmatic patients compared to control subjects or asthmatics treated by inhaled corticoids. These results suggest that CCL18 plays a role in the allergic reaction. Second, corticoid effects on CCL18 production were evaluated. Corticoid treatment induced a 2. 5 fold increase in serum CCL18 levels in asthmatic patients, whereas it did not modify them in patients with chronic obstructive pulmonary disease, who exhibit elevated serum CCL18. Serum CCL18 levels were normal in patients with cystic fibrosis, not modified by corticoids, and correlated to serum IL-13. These results suggest that corticoids regulate CCL18 expression depending on the pathology. This observation was confirmed in vitro. Indeed, dexamethasone increased IL-4- and IL-10-induced CCL18 production, but inhibited LPS-induced CCL18 production. Third, the effect of environmental factors, particularly diesel exposure, was analysed. Diesel activation of PBMC from allergic patients induced a late increase in CCL18 exposure, with or without allergen exposure, suggesting a role of this chemokine in the diesel effect on the allergic reaction. Finally, we found increased serum and pleural CCL18 in patients with pleural mesothelioma. In this pathology, T cell number was lower in pleura whereas IL-10 levels and T regulatory cell numbers were higher compared to benign pleural lesions. CCL18 was correlated to the number of infiltrated NK cells. The local presence of pro- and anti-tumoral cells will need further studies to better understand their involvement. Studies to evaluate the in vivo role of CCL18 are limited due to the absence of a murine homologue. Therefore, a model was established in SCID (Sever Combined ImmunoDeficient) mice grafted with human skin in order to analyse the effect of chemokines and their receptors in vivo. We firstly evaluated the role of CCR5 in the CCL5 (RANTES)-induced leukocyte recruitment in this model. CCL5 induced a significant recruitment of memory T cells, monocytes/macrophages, eosinophils and IFN-γ+ cells but not IL-4+ or IL-5+ cells. CCR5 inhibition induced a complete inhibition of the recruitment of monocytes/macrophages and IFN-γ+ cells, although these cells express other receptors for CCL5, but did not modify eosinophil recruitment. These results suggest that the in vivo environment regulates CCL5 targets, leading to a differential cell recruitment. We secondly analysed the effect of CCL18 after intradermal injection. Preliminary results show a recruitment of CD4+CD45RA+, CD4+CD45RO+, CD4+CD25+ and IL-10+ cells, suggesting that, as shown in in vitro studies, CCL18 attracts naïve T cells but also memory and possibly regulatory T cells, this being to be confirmed. CCL18 receptor is still unknown. Our goal was to clone this receptor using molecules produced in eukaryotic cells. CCL18 expressing vectors and a soluble fusion protein made of CCL18 fused to the Fc portion of human or murine IgG1 was constructed. These molecules were expressed in CHO and HEK293 eukaryotic cell lines. We established methods for sufficient secretion and efficient purification. These purified molecules will be further used for the receptor cloning from a cDNA bank.

Consulter en bibliothèque

La version de soutenance existe sous forme papier

Informations

  • Détails : 1 vol. (165 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 133-160. Notes bibliogr.

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université du droit et de la santé. Service Commun de la Documentation. BU Santé - Learning center.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 50.379-2005-19-C
Voir dans le Sudoc, catalogue collectif des bibliothèques de l'enseignement supérieur et de la recherche.