Etude des évènements cinétiques initiaux du repliement de l'apomyoglobine

par Sébastien Weisbuch

Thèse de doctorat en Biologie structurale et nanobiologie

Sous la direction de Marc Jamin.

Soutenue en 2005

à l'Université Joseph Fourier (Grenoble) .

    mots clés mots clés


  • Résumé

    Un polypeptide néosynthétisé est capable de trouver rapidement le chemin vers sa structure tri-dimensionnelle finale, en passant par des intermédiaires partiellement structurés. L'acquisition d'information sur le rôle et l'importance de ces intermédiaires est rendu difficile parce qu'ils se forment très rapidement pendant la réaction de repliement et que cette période de temps n'est pas accessible aux appareils de mélange usuels. L'objet de cette thèse était de caractériser les évènements cinétiques initiaux du repliement des protéines, notamment de l'apomyoglobine (apoMb), en utilisant des appareils de mélange ultra-rapide. Un appareil de type stopped-flow équipé d'une micro-cuve permis de diminuer le temps mort de ce type de mélangeur. Une réaction bimoléculaire (NATA et NBS), à permis d'évaluer le temps mort à 400±10us, dans un mode d'utilisation permettant de suivre simultanément le signal de fluorescence et le signal de dichroïsme circulail dans l'UV lointain. L'apoMb est une protéine particulièrement intéressante pour l'étude des évènements précoces du repliement des protéines. Le stopped-flow ultra rapide, a permis de suivre des cinétiques (k jusqu'à 1500 s-1) permettant de montrer que chaque étape précédemment identifiée, conduisant l'apoMb de sa forme dépliée à sa forme native (soit les réactions U la, la Ib, et Ib N), présente les caractéristiques typiques d'une réaction à deux états, hautement coopérative. Nous avons étudié l'effet d'osmolytes sur les cinétiques et sur la stabilité à l'équilibre des formes U, 1 et N de l'apoMb. Des études cinétiques en présence de sucrose ont permis d'observer le comportement de la réactions U la.


  • Pas de résumé disponible.

  • Titre traduit

    Study of initial kinetic events of apomyoglobin folding


  • Résumé

    A neo-synthesized polypeptide is able to found its specific pathway upon several accessible ways to its final three-dimensional structureby passing trough partially structured intermediate in a very short time. Collecting data in order to improve our knowledge on this intermediate is crucial, but it's necessary to improve mixing apparatus to be able to record the protein fast events of folding. The purpose of these thesis was to follow fast protein folding events, in particular apomyoglobin (apoMb), by using ultra fast mixing apparatus. A stopped-flow apparatus with a customized micro-cuve, decreases the mixing time. A bimolecular reaction (Nata & NBS) was used to determine a 400±10us dead time, in fluorescence and far UV circular dichroïsm modes. ApoMb is a particularly interesting protein for the study of early protein folding events. The ultra-fast stopped-flow allowed us to follow rapid kinetics (k up to 1500 s-1). The data show that each previously identified steps leading unfolded apoMb to its native conformation, namely the U la, the la Ib and the Ib N reactions, exhibits a two-state highly cooperative behaviour. We studied the effects of osmolytes on the kinetics and on the equilibrium stability of U, 1 and N forms of apoMb. Fast kinetic studies in the presence of sucrose, allow to show the behaviour of the U la reaction. These results show that sucrose destabilizes, the U form and the transition state of the U la reaction relative to the la form. The rate limiting step appears to precede compaction of the peptidic chain. Ln the same conditions the Ib N transition shows transition state characteristics close to those of the Ib state.

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Informations

  • Détails : 170 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 156-170

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  • Bibliothèque : Service interétablissements de Documentation (Saint-Martin d'Hères, Isère). Bibliothèque universitaire de Sciences.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : TS05/GRE1/0016
  • Bibliothèque : Service interétablissements de Documentation (Saint-Martin d'Hères, Isère). Bibliothèque universitaire de Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TS05/GRE1/0016/D
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