Modelage des génomes fongiques pour la transformation des parois végétales : conception et surproduction de nouveaux outils enzymatiques chimères

par Anthony Levasseur

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé. Microbiologie moléculaire et biotechnologie

Sous la direction de Marcel Asther.


  • Résumé

    Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont eu pour objectif de i) concevoir et surproduire chez les champignons filamenteux de nouveaux outils enzymatiques performants pour la dégradation de la biomasse végétale et ii) d’étudier les relations synergiques existant au sein de ces enzymes hybrides bi- ou multi-modulaires. Dans une première partie, des enzymes libres impliquées dans la dégradation des hémicelluloses ont été surproduites chez Aspergillus niger (la féruloyl estérase B, FAEB et la xylanase B, XYNB). Les niveaux de production en fioles ont atteint respectivement, 100 mg. L-1 et 900 mg. L-1 pour la FAEB et XYNB. Ces protéines recombinantes ont été purifiées puis caractérisées. La seconde partie de l’étude a porté sur la conception et la production d’enzymes chimères dans lesquelles des modules d’intérêt ont été rapprochés physiquement en utilisant des fusions traductionnelles. Dans cette étude, la production d’une protéine chimère basée sur le modèle des enzymes cellulosomales bactériennes a été réalisée chez A. Niger. Ces travaux ont permis de produire la première enzyme fongique, FAEA, fusionnée à un module bactérien dockérine fonctionnel. Le travail sur les protéines chimères a été élargi en fusionnant deux enzymes complémentaires, la FAEA et XYNB afin d’améliorer l’efficacité enzymatique globale en favorisant l’action synergique entre les partenaires fusionnés. De plus, dans une seconde construction, un module de fixation à la cellulose (CBM) a été additionné à cette protéine bifonctionnelle pour étudier l’effet du ciblage vers le substrat. Ces enzymes bifonctionnelles ont été surproduites (~1,5 g. L-1), caractérisées et testées dans le cadre du relargage d’un composé à haute valeur ajoutée, l’acide férulique à partir de sous-produits agricoles et se sont montrées plus efficaces que les enzymes libres correspondantes. Par conséquent, le rapprochement physique entre une enzyme principale (XYNB) et une enzyme secondaire (FAEA) ainsi que le ciblage apporté par le module non-catalytique (CBM) a permis de favoriser la synergie enzymatique et représente une stratégie intéressante pour l’amélioration enzymatique. Une dernière étude basée sur une nouvelle enzyme hybride a été également réalisée, chez un nouvel hôte, dans le cadre de cette thèse. La construction de ces protéines chimères performantes présente de grands intérêts dans de nombreuses applications du domaine de la chimie verte, notamment pour la production de biocarburants à partir de la biomasse végétale.

  • Titre traduit

    Fungal genome modelling for the transformation of plant-cell wall : design and overproduction of new chimeric enzymatic tools


  • Résumé

    The objectives of this thesis were i) to design and overproduce new and efficient enzymatic tools in filamentous fungi involved in the plant-cell-wall degradation and ii) to study the synergistic relationships of the corresponding bi- or multi-modular hybrid enzymes. Firstly, free hemicellulolytic enzymes were overproduced in Aspergillus niger (feruloyl esterase B, FAEB and xylanase B, XYNB). Production yields reached 100 mg. L-1 et 900 mg. L-1 for FAEB and XYNB, respectively. Recombinant proteins were purified and fully characterized. Secondly, this study concerned the design and production of chimeric enzymes, in which modules of interest were fused together to enable physical proximity between them. In this study, a chimeric enzyme, based on the model of bacterial cellulosome, was produced in A. Niger. The first fungal enzyme, FAEA, fused to a functional bacterial dockerin module, was successfully produced. Our work was extended to others hybrid proteins by fusing two complementary enzymes, FAEA and XYNB in order to improve the enzymatic efficiency, by increasing synergistic effect of the fused enzymes. Moreover, in a second construction, a Carbohydrate-Binding Module (CBM) was added to the bifunctional enzyme to study the effect of the substrate targeting. These bifunctional enzymes were overproduced (~1,5 g. L-1), characterized, and tested for the ferulic-acid release from agricultural by-products and their action was improved as compared to that of the corresponding free enzymes. Therefore, physical proximity between these primary (XYNB) and secondary (FAEA) enzymes and the substrate targeting by the CBM promote the enzymatic synergy. Finally, a new hybrid enzyme was designed in a new host in this work. The design of these improved chimeric enzymes is of great interest for future applications in industrial sectors, such as the biofuel production from vegetal biomass.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (195 f.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury à compter du 01.01.2007
  • Annexes : Bibliographie f. 159-187

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université d'Aix-Marseille (Marseille. St Charles). Service commun de la documentation. Bibliothèque universitaire de sciences lettres et sciences humaines.
  • Disponible pour le PEB
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