Contrôle génétique de la prolifération cellulaire chez le médaka : analyses fonctionnelles et amélioration de la transgénèse grâce à l'utilisation de la méganucléase I-SceI

par Violette Thermes

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Jean-Stéphane Joly.

Soutenue en 2004

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des Sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .


  • Résumé

    Le développement embryonnaire fait appel aux processus de la division, de l’apoptose, de la migration et de la différenciation cellulaire. Leur coordination permet aux organes d’acquérir leur fonction et leur morphologie exactes. Afin d’isoler de nouveaux régulateurs impliqués dans le contrôle de la prolifération cellulaire, un crible génétique par hybridation in situ a été réalisé sur des embryons de médaka (Oryzias latipes). L’objectif est de caractériser in vivo la fonction de gènes issus de ce crible. Dans un premier temps, j’ai contribué à mettre en évidence le rôle de régulateur négatif de la prolifération d’un gène de la famille GADD45, grâce à des expériences d’inactivation et d’expression ectopique de ce gène. Je me suis ensuite intéressée à la caractérisation du gène simplet qui appartient à une nouvelle famille de gènes spécifiques des vertébrés et de fonction encore inconnue. Les résultats indiquent clairement que le gène smp a un rôle majeur dans la progression des cellules à travers le cycle cellulaire précoce. Parallèlement, nous nous sommes attachés à faire de la transgénèse, jusqu’à présent peu efficace chez le poisson, un outil simple et performant. Nous avons montré que la linéarisation du transgène en co-injectant la méganucléase I-SceI, diminue fortement le mosaïcisme et augmente le taux d’individus transgéniques. Enfin, nous avons commencé la réalisation d’une stratégie d’intégration ciblée qui utilise la capacité naturelle qu’a I-SceI d’induire une recombinaison homologue au niveau d’une cassure double brin dans le génome. Les premières injections réalisées suggèrent qu’il est possible de cibler efficacement l’intégration du transgène.

  • Titre traduit

    The genetic control of cell proliferation in the medaka fish : fonctional analyses and improvement of transgenesis using the I-SceI meganuclease


  • Résumé

    Embryonic development depends on the control of cell division, apoptosis, migration and cell differentiation. Coordination of these processes allows organs to attain their morphology and their function. In order to isolate new potential cell cycle regulators, a genetic screen by in situ hybridization on medaka embryos (Oryzias latipes) was performed in the laboratory. The purpose of the thesis was the in vivo functional characterization of candidate genes. First, we pointed out the role of a member of the GADD45 family as a negative regulator of cell proliferation. To evaluate its function, we performed some experiments of inactivation and ectopic expression using micro-injections in the egg. Results allowed us to validate our in vivo experimental approach. We then focused on the characterization of the simplet (smp) gene, which belongs to a new family of vertebrate genes with a still unknown function. We thus proposed that in early embryos, smp plays a major role in the progression of cells through the cell cycle. In a second part, we aimed to turn the fish transgenesis into a simpler and more efficient tool. Until now, this technique displayed a limited efficiency when used in fish. We showed that the in ovo linearization of the transgene by co-injecting the I-SceI meganuclease, leads to a strong reduction of mosaicism and to an increase of transgenic rates. Finally, we began to develop a strategy for transgene targeted integration. This strategy is based on the natural capacity of meganucleases to induce a double strand-break repair by homologous recombination. The preliminary results sustain the possibility of an efficient targeting of the transgene into the genome.

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Informations

  • Détails : 193 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 111-118

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 0g ORSAY(2004)295
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