Usines de réplication et de réparation de l'ADN chez la levure Schizosaccharomyces pombe

par Peter Meister

Thèse de doctorat en Sciences biologiques. Génétique

Sous la direction de Guiseppe Baldacci.


  • Résumé

    En présence de lésions double-brin sur l'ADN, les mécanismes de signalisation et de réparation des cassures sont activés. Cette activation se traduit par la formation de structures sub-nucléaires rassemblant les cassures, les facteurs de réparation et de signalisation des dommages. Dans l'organisme modèle Schizosaccharomyces pombe, nous avons utilisé les techniques de microscopie de fluorescence in vivo et des protéines de fusion fluorescentes pour mettre en évidence ces structures. Dans une première étude, nous avons montré que les facteurs de signalisation des dommages et de réparation des cassures double brin colocalisent après induction de cassures double-brin par irradiation gamma. Ces " foci " ou " usines " colocalisent également partiellement avec PCNA, un facteur ubiquitaire de réparation et de réplication de l'ADN. La levure fissipare permettant une analyse génétique aisée, nous avons également étudié la génétique de la formation de ces usines. Dans une seconde étude, nous nous sommes intéressés à la relation entre réplication et recombinaison lors du blocage des fourches de réplication par déplétion du réservoir de désoxyribonucléotides. L'approche adoptée est basée sur l'utilisation des souches permettant d'observer in vivo simultanément un facteur de recombinaison et un facteur de réplication. Nous avons montré que lorsque les fourches sont bloquées, l'absence du système de surveillance de la structure de l'ADN (checkpoint) intra-S induit l'apparition d'usines de recombinaison. De plus, dans des souches sauvages, nous montrons également que suite à un blocage des fourches, la recombinaison est retardée jusqu'à l'achèvement de la phase S par ce même système de surveillance. Enfin, il semble que la recombinaison induite par l'absence de checkpoint de phase S en absence de nucléotides conduise au moins partiellement à des remaniements de la fourche de réplication et à son inactivation. La troisième étude présentée ici concerne l'organisation spatio-temporelle de la réplication de l'ADN chez S, pombe. Lors de la phase S, PCNA forme de foci subnucléaires. Nous montrons pour la première fois in vivo dans un organisme unicellulaire que ces foci sont des usines de réplication (rassemblement de plusieurs fourches de réplication), Ces usines de réplication présentent une organisation reproductible dans le temps et l'espace intranucléaire. Enfin, nous analysons la dynamique de ces usines, ainsi que l'effet de mutations du checkpoint de phase S sur l'organisation de la réplication de l'ADN.


  • Résumé

    When double-strand breaks are detected on DNA, signaling and repair processes are activated. Activation can be visualized in vivo following the formation of sub-nuclear structures composed of DNA ends, repair and signaling factors. In the model organism Schizosaccharomyces pombe, we revealed these structures in vivo, using fluorescence microscopy and fluorescent fusion proteins. In a first study, we show that signaling factors colocalise with repair factors after induction of DSBs by gamma irradiation. Moreover, these "foci" or "factories" colocalise partially with PCNA, a ubiquitous DNA repair and replication factor. Taking advantage of fission yeast easy genetic analysis, we also studied the genetic determinant of factories formation. In a second study, we were interested by the relationship between replication and recombination after-replication forks blockage by depletion of the desoxyribonucleotides pool. The study is based on strains allowing simultaneous visualization of a replication and a recombination factor. We show that in the presence of replication fork blocks, lack of intra-S phase checkpoint induces appearance of recombination foci. Moreover, in wild-type cells, the intra-S checkpoint delays recombination till replication is almost complete following replication forks blockage. Finally, recombination induced by the absence of intra-S checkpoint in the absence of nucleotides seems to be at least partially responsible for replication fork collapse. In the third study presented here, we describe the spatial and temporal organization of DNA replication in S. Pombe. During S-phase, PCNA forms sub-nuclear foci. We show for the first time in vivo in a unicellular organism that these foci are replication factories (clusters of replication forks). These replication factories display reproducible temporal and spatial organization. Finally, we analyze the dynamics of these factories, as well as the effects of deleting components of the intra-S checkpoint on the organization of DNA replication.

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Informations

  • Détails : 187 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p.175-187

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  • Bibliothèque : Université Paris-Sud (Orsay, Essonne). Service Commun de la Documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 0g ORSAY(2004)124
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