Regulation and function of the DeltaNp73 isoforms after DNA damage

par Carine Maisse

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire

Sous la direction de Gerry Melino et de Guido Kroemer.

Soutenue en 2004

à Paris 6 en cotutelle avec l'Università degli studi di Roma "Tor Vergata" .

  • Titre traduit

    Etude des régulations et fonctions des isoformes DeltaNp73 après d""ommages à l'ADN


  • Pas de résumé disponible.


  • Résumé

    Les cellules d’un organisme subissent chaque jour des stress dus à l’environnement (rayons UV, agents chimiques, métaux lourds) pouvant conduire à des lésions du patrimoine génétique ou à un déséquilibre de l’état RedOx. De nombreux systèmes cellulaires permettent tout d’abord d’identifier le dommage puis d’induire éventuellement la réparation de l’ADN ou la mort de la cellule si le dommage subi est irréversible. Une cellule cancéreuse est le résultat d’échecs cumulés des systèmes de contrôle intra et extra-cellulaires et de mort programmée. Identifiée en 1979, la protéine p53 est un facteur de transcription muté dans 50% des cancers. Elle joue un rôle central dans la régulation de la prolifération cellulaire, de la réparation de l’ADN et de l’apoptose après stress, génotoxique ou non. Etonnamment, p53 semblait jouer seule ce rôle prépondérant qui lui a valu la dénomination de "gardienne du génome", et, pendant 20 ans, toutes tentatives pour caractériser d'éventuels homologues sont restées vaines. En 1997, p73, un homologue de p53, fut identifiée dans la bande p36 du chromosome 1, une région dont la délétion est souvent associée à de nombreux neuroblastomes. La caractérisation de p73 fut accueillie avec enthousiasme et sa grande homologie avec p53 semblait pouvoir expliquer les 50% de cancers présentant une p53 non mutée. L'année suivante, un deuxième homologue fut identifié et caractérisé: p63. Les trois membres de la famille p53 présentent une grande homologie, notamment dans le domaine de liaison à l'ADN : p73 et p63 sont en effet capables d'activer l'expression de nombreux gènes cibles de p53 et d'induire l'apoptose ou de bloquer le cycle cellulaire. Toutefois, 6 ans après leur découverte, p73 et p63 semblent de plus en plus différents de leur "parente" p53. La génération et l'étude de souris déficientes pour les membres de la famille illustrent ces différences : si les souris manquant p53 atteignent normalement l'âge adulte et développent spontanément des tumeurs, les souris manquant p73 ou p63 présentent de graves troubles du développement embryonnaire, indiquant un rôle majeur dans la différenciation cellulaire. Si p73 et p63 présentent une structure globale comparable à p53 (un domaine de transactivation, un domaine de liaison à l’ADN et un domaine d’oligomérisation, impliqué dans la tétramérisation de la protéine nécessaire à son activité transcriptionnelle), elles possèdent en effet un prolongement du domaine C-terminal, absent de la séquence de p53, et qui semble impliqué dans leurs propriétés propres. La maturation des transcrits de p73 et p63 donne lieu à différents splicing variants (6 pour p73 et au moins 3 pour p63) en C-terminal, dont les fonctions transcriptionnelles et le pattern d'expression sont différents. De plus, les formes les plus longues des deux protéines présentent un domaine SAM (Sterile Alpha Motif), commun à de nombreuses protéines impliquées dans le développement. Ce domaine est souvent muté dans des syndromes humains impliquant p63, ce qui laisse présager un rôle important dans la régulation de l'activité de p63 et p73. Par ailleurs, des formes tronquées en N-terminal ont été décrites dans la souris : ces formes sont nommées ΔΝ, elles ne possèdent pas le domaine de transactivation, au contraire des formes longues (TA). Ainsi, ΔΝp73 et ΔΝp63 agissent dans la souris comme dominants négatifs des fonctions pro-apoptotiques de TAp73 et TAp63. Il a été établi par la suite que ΔΝp73 et ΔΝp63 sont transcrites à partir d'un second promoteur, localisé dans le troisième intron de la forme longue. L'étude présentée ici décrit la première caractérisation de la forme ΔΝp73 humaine, la régulation de son expression et de son activité. De même que ΔΝp73 murine, la forme humaine inhibe les fonctions pro-apoptotiques de TAp73 et p53, via interactions protéines/protéines ou compétition pour les sites de liaison sur les promoteurs cibles. De plus, la présence d’un élément de réponse à p53 situé dans le promoteur de ΔΝp73 caractérise une boucle de régulation négative qui s’ajoute à la boucle de régulation MDM2/p53. ΔΝp73 agissant comme un oncogène, il semble donc que le ratio ΔΝ/TA ou ΔΝ/p53 soit fondamental à l’équilibre cellulaire et que sa dérégulation puisse être impliquée dans la formation tumorale, ce ratio pouvant être contrôlé au niveau transcriptionnel ou post-traductionel de la protéine ΔΝp73. L’étude du promoteur de ΔΝp73 a mis en évidence de nombreux éléments de réponse à différents facteurs de transcription. De récents travaux ayant associé une augmentation de ΔΝp73 à certains types de neuroblastomes, nous nous sommes particulièrement intéressés à N-Myc, facteur de transcription également amplifié dans certains neuroblastomes. Nous n’avons pu toutefois mettre en évidence une activation transcriptionnelle directe de ΔΝp73 de la part de N-Myc, mais d’autres éléments de réponse restent encore à caractériser, notamment NFκB et p300, tous deux impliqués dans la régulation de l’apoptose. Par ailleurs, l’étude de modifications post-traductionnelles de ΔΝp73 a mis en évidence une rapide dégradation de la protéine après dommages à l’ADN induits par rayons Ultra-Violets ou traitement par drogues, libérant ainsi p53 et TAp73 de son inhibition et permettant ainsi l’apoptose ou l’arrêt du cycle cellulaire. De plus, notre étude a mis en évidence une très brève hémie-vie de la forme ΔΝ par rapport aux formes contenant le domaine de transactivation. Ainsi, le ratio ΔΝ/formes longues pourrait également dépendre d’une fine régulation de la dégradation des deux protéines.

  • Titre traduit

    Regolazione e funzione delle isoforme ΔΝp73 dopo danno al DNA


  • Résumé

    In our search for the underlying causes of cancer, TP53 is the most intensively studied gene. P53 plays a central role for balancing the antagonistic processes of proliferation and apoptosis. As a sequence-specific transcription factor, p53 regulates the expression of genes involved in cell cycle arrest and apoptosis in response to genotoxic damage or cellular stress. Failure of p53 function consequently leads to uncontrolled cell growth, a defining feature of cancer cells. Given the importance of p53 as a tumor suppressor, it is therefore no wonder that p53 is the most frequent site of genetic alterations found in human cancers. The recent discovery of two TP53-related genes, TP73 and TP63 with striking sequence homology, was therefore a big surprise, raising the possibility that other tumor suppressors exist which share the power of p53 in preventing cancer formation. The three members of the p53 family share significant homology both at the genomic and at the protein level. The highest level of identity is reached in the DBD (DNA-Binding Domain), suggesting that they can bind to the same DNA sequence and transactivate the same promoters. In fact, p73 and p63 are able to activate some p53 targets and to induce apoptosis, but they appear more and more different from their relative. The study of the respective knock-out mice gives a good illustration of these differences : while p53-null mice develop normally but present spontaneous tumors, the p73 and p63-null mice present severe developmental troubles but no spontaneous tumors, indicating that they may have more complex functions. Conversely to p53, p73 and p63 contain additional C-terminal extensions. In both proteins, these extensions show alternative splicing, which results in at least six C-terminal variants for p73 and three for p63. These isoforms have different transcription and biological properties, and their expression patterns change among normal tissues. Moreover, the α variants of p73 and p63 have close to their C terminus a SAM (Sterile Alpha Motif) domain, which is thought to be responsible for regulating p53-like functions, and is implicated in various human syndromes where p63 is mutated. In addition to the C-terminal variants aminoterminous truncated variants of p73 and p63 exist : ΔNp73 and ΔΝp63. These N-terminally truncated isoforms lack the transactivation domain (TA), which is coded by the first 3 exons, and derive from the use of an alternative promoter (P2) located in intron 3 and an additional exon (exon 3'). While TAp73 isoforms work as transcription factors and can induce irreversible cell cycle arrest and apoptosis like p53, the ΔNp73 isoforms that lack the transactivation domain are incapable of directly inducing gene expression and do not induce growth arrest or cell death. However, the ΔNp73 forms have a very important regulatory role, since they exert a dominant negative effect on p53 and TAp73 by blocking their transactivation activity, and hence their ability to induce apoptosis. The relative levels of expression of the ΔNp73 isoforms can therefore determine the function of both TAp73 and p53. It is most interesting that the ΔNp73 promoter (P2) contains a very efficient p53/p73 responsive element and consequently, p53 and TAp73 efficiently induce ΔNp73 expression. Moreover, upon strong DNA damage, induced by UV irradiation or drug treatment, ΔNp73 is rapidly degraded, releasing the block exerted on p53 and TAp73 and thus allowing cell cycle arrest and apoptosis to proceed. Hence, ΔNp73 is part of a dominant negative feedback loop that regulates the function of both p53 and TAp73 and this regulation can be overcome in case of strong DNA damage.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (X-145 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 116-143. 372 réf. bibliogr.

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  • Bibliothèque : Université Pierre et Marie Curie. Bibliothèque Universitaire Pierre et Marie Curie. Section Biologie-Chimie-Physique Recherche.
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  • Cote : T Paris 6 2004 598
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