Clonage et caractérisation de gènes différentiellement exprimés chez la levure pathogène opportuniste Candida lusitaniae au cours de la pseudofilamentation

par Abdelhak Goumar

Thèse de doctorat en Pharmacie. Sciences de la vie et de la matière

Sous la direction de Jean Villard.

Soutenue en 2004

à Paris 5 , dans le cadre de École doctorale du Médicament (....-2009Paris) , en partenariat avec Université Paris Descartes. Faculté de pharmacie de Paris (autre partenaire) .


  • Résumé

    Candida lusitaniae est une levure saprophyte qui peut se comporter comme pathogène opportuniste chez des personnes immunodéprimées. Comme d'autres espèces du genre Candida, cette levure est capable de passer d'un état blastospore à un état morphologique plus complexe, le pseudofilament. L'objectif de notre travail était de déterminer s'il existait une relation entre la pseudofilamentation et la virulence, et puis de cloner des gènes différentiellement exprimés au cours de cette transition morphogénétique. Nous avons tout d'abord montré que la pseudofilamentation in vitro était déclenchée par un stress nutritionnel, tel qu'une carence en ion ammonium et en glucose. La sélection et l'analyse génétique de mutants déficients pour la pseudofilamentation, a montré que deux mutations dans deux gènes différents étaient nécessaire pour conférer un phénotype stable. Un mutant déficient pour la pseudofilamentation était avirulent chez la souris par rapport à la souche sauvage dont il était issu. Les études histologiques et microbiologiques des reins de souris infectées ont indiqué que la forme pseudofilament n'était pas différenciée pour coloniser les tissus, et que l'avirulence du mutant était due à des capacités d'adhérence réduites, ce qui a été confirmé par des expériences d'adhérence in vitro. Nos résultats suggèrent que la pseudofilamentation en elle-même n'a probablement pas de rôle direct dans la virulence de C. Lusitaniae, mais qu'elle contribue par l'intermédiaire des facteurs associés. Par une technique d'hybridation soustractive nous avons cloné et identifié huit gènes surexprimés chez la souche sauvage en phase de pseudofilamentation et 4 gènes surexprimés chez le mutant MFs1 bloqué au stade blastospore. La plupart des protéines exprimées au cours de la pseudofilamentation chez les sauvages, sont des enzymes du métabolisme énergétique glycolytique et glyoxylique ce qui montre le rôle important de l'énergie dans la transition morphologique chez C. Lusitaniae. Un gène spécifique du règne fongique, le facteur 3 d'élongation de la traduction a également été isolé. Les gènes isolés, chez le mutant, en particulier, un transporteur de glucose à haute affinité, laisse supposer que la souche est affectée dans la perception de son environnement nutritionnel. Deux gènes surexprimés en phase pseudofilamentation ont été clonés et caractérisés. Il s'agit du gène MLS1 codant une enzyme clé du cycle glyoxylique, et le gène TEF3 codant pour le facteur 3 d'élongation. L'inactivation du gène MLS1 a été réalisée. Elle provoque un défaut dans croissance de la levure sur les sources de carbone non fermentables, mais n'a aucun effet sur la pseudofilamentation. En revanche, nos résultats ont clairement démontré que l'expression du gène TEF3 était réprimée au stade blastospore et qu'elle était fortement induite en phase de pseudofilamentation sur milieu solide. Le gène TEF3, spécifique du règne fongique, et surexprimé au cours de la pseudofilamentation, joue un rôle dans la virulence, constitue donc une cible de choix pour le développement de nouveaux antifongiques.

  • Titre traduit

    Cloning and characterization of genes differentially expressed during pseudohyphal growth of the opportunistic pathogenic yeast Candida lusitaniae


  • Résumé

    Candida lusitaniae is a saprophytic yeast that can behave as an opportunistic pathogen in immunocompromised patients. As others Candida species, this yeast is able to switch from unicellular yeast to pseudohyphae. The aim of this study was to investigate a possible relationship between pseudohyphal growth and virulence, and to clone genes differentially expressed during this morphogenetic transition. We first demonstrated that pseudohyphal growth was triggered and supported in vitro by nutriment factors depletion, mainly ammonium ions and glucose. A pseudohyphae-defective mutant was shown to have attenuated virulence in mice when compared to the wild-type. Histological studies of infected kidneys showed that pseudohyphal growth was not used for tissue colonization, and that avirulence was derived from impaired adherence properties, as confirmed by in vitro adherence tests. Using a suppressive subtractive hybridization method, we cloned and identified eight genes of the wild type strain surexpressed during pseudohyphal growth and four genes of the mutant strain surexpressed during unicellular growth. Most of the proteins identified during pseudohyphal growth were glycolytic and glyoxylic enzymes, suggesting the important role of energy-requirement during morphologic transition. A specific gene of the fungal kingdom, the elongation factor 3 of translation, has been also isolated. For the mutant, a high-affinity glucose transporter was isolated, suggesting that the strain was affected in the sensing of its nutritional environment. Two genes over-expressed during pseudohyphal form were cloned and characterized. MLS1, encoding a key enzyme of the glyoxylate cycle, and TEF3 encoding elongation factor 3. Disruption of MLS1 resulted in delayed growth with non-fermentable carbon source, but had no detectable effect in pseudohyphal growth. On the other hand, our results demonstrated that expression of TEF3 was repressed under unicellular form and specifically induced during pseudohyphal form, which makes this gene a possible target for antifugal drug development.

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Informations

  • Détails : 123 f.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 108-123

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