Etude fonctionnelle du domaine homologue à la Sex Hormone Binding Globulin (SHBG) de la protéine S et relation génotype-phénotype du récepteur des cellules endothéliales de la protéine C (EPCR), deux cofacteurs du système de la protéine C

par Béatrice Fareau-Saposnik

Thèse de doctorat en Pharmacie. Hémostase

Sous la direction de Sophie Gandrille.


  • Résumé

    Trois cofacteurs interviennent dans le système anticoagulant naturel de la protéine C (PC) : la thrombomoduline (TM), le récepteur des cellules endothéliales à la PC (EPCR) et la protéine S (PS). Les deux premiers jouent un rôle dans la première étape du système, en permettant au zymogène qu'est la PC d'être activé en PC activée (PCa), tandis que la PS exerce son rôle de cofacteur en augmentant la vitesse de protéolyse des facteurs Va et VIIIa de la coagulation par la PCa, protéolyse qui limite la génération de thrombine. Si l'effet cofacteur de la TM est clair (elle accélère la réaction d'activation de la PC en PCa d'un facteur 20000), ceux de la PS et de l'EPCR sont en revanche atypiques, puisque les facteurs d'accélération qu'ils confèrent aux réactions enzymatiques ne sont que de 5 et 20, respectivement. Pourtant, l'importance physiologique de la PS est indéniable au regard de la sévérité de l'expression clinique du déficit homozygote en cette protéine. C'est cette discordance entre la sévérité de l'expression clinique du déficit et ce qu'on connaît des fonctions de la PS qui a motivé la première partie de notre étude. Nous nous sommes focalisée sur un domaine de la PS dont les fonctions étaient peu connues et qui en constitue une particularité structurale puisqu'il n'est présent dans aucune autre protéine de la coagulation. Ce domaine, homologue à la Sex hormone binding globulin (domaine SHBG), a été exprimé en système eucaryote, seul (rSHBG) ou avec son domaine adjacent dans la protéine naturelle (rEGF4-SHBG). Les deux modules recombinants ont été purifiés, caractérisés biochimiquement ; nous avons montré qu'ils adoptent une conformation identique à celle de la PS native, possèdent leur propre autonomie de repliement, que le domaine SHBG est seul responsable de la liaison de la PS à la C4b-binding protein, et contient un site de liaison au Ca2+, ce qui n'avait jamais été démontré de façon directe auparavant. Par contre, ce domaine est dépourvu en lui-même d'activité cofacteur pour la PCa, mais contribuerait à l'activité de la PS en maintenant ses autres domaines dans une conformation permettant une interaction optimale avec la PCa. Dans la seconde partie de notre travail, nous nous sommes attachée à rechercher des anomalies génétiques de l'EPCR. La découverte de telles anomalies associées à un risque de thrombose serait un argument fort en faveur de l'importance physiologique de l'EPCR dans la régulation de la coagulation humaine. Ce risque de thrombose peut être lié soit à une diminution de l'expression de l'EPCR membranaire ou à l'inverse, à une augmentation de la forme plasmatique soluble de ce récepteur (EPCRs) qui inhibe la PC et la PCa. Des taux élevés d'EPCRs ont été décrits chez environ 20% des sujets de la population générale sans qu'origine et conséquences cliniques n'aient été identifiées. En dosant l'EPCRs chez 100 sujets sains, nous avons retrouvé cette proportion de sujets ayant un taux élevé d'ERCRs et constaté une stabilité temporelle de ces taux, ce qui était en faveur d'un contrôle génétique. . .

  • Titre traduit

    Functional properties of the Sex Hormon Binding Globulin (SHBG)-like domain of protein S and genotype-phenotype relationship of the endothelial cell protein C receptor (EPCR), two cofactors of the protein C pathway


  • Résumé

    Three cofactors participate to protein C (PC) anticoagulant pathway, the thrombomodulin (TM), the endothelial protein C receptor (EPCR) and the protein S (PS). TM and EPCR are involved in the first step of the pathway by accelerating the PC activation step, whereas PS increases factors Va and VIIIa inactivation by activated PC (aPC), thereby inhibits further thrombin generation. If TM plays an unequivocal role by increasing by 20000 fold the PC activation into aPC, the role of PS and EPCR are more elusive since enzymatic reactions they favorize are increased by 20 or 5 fold, respectively. Nevertheless, the severe thrombotic disease observed in patients with homozygous protein S deficiency highlights the key role of PS in maintaining blood fluidity. Then, the mechanism by which PS inhibits coagulation in vitro remained to be elucidated, and this motivated the first part of our study. We focussed our work on the PS C-terminal domain, which is a sex hormone binding globulin (SHBG)-like domain which replaces the serine protease domain found in other vitamin K dependent plasma proteins, the functions of which are unclear. We expressed the PS SHBG-like domain alone or together with its adjacent domain EGF4. These both recombinant modules were purified and their biochemical features revealed that they adopted the conformation of native PS, indicating that PS SHBG-like region is an independent folding unit. We also obtained the first evidence that the SHBG-like domain alone is sufficient to support the interaction with C4b-binding protein, and contains one Calcium binding site. However, neither recombinant module exhibited aPC cofactor activity in a clotting assay, suggesting that the PS SHBG-like domain must be part of the intact molecule for it to contribute to aPC activity, possibly by constraining the different domains in a conformation that permits optimal interaction with aPC. . .

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Informations

  • Détails : 115 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. f. 94-115

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  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TPHB 9150
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