Implication de la phospholipase D et de son produit, l'acide phosphatidique, dans la différenciation myogénique

par Hiba Komati

Thèse de doctorat en Biochimie

Sous la direction de Georges Nemoz.

Soutenue en 2004

à Lyon, INSA .


  • Résumé

    Lors de la myogénèse, les myoblastes précurseurs sortent du cycle cellulaire, fusionnent, et expriment l'appareil contractile myocytaire. Des données préliminaires suggéraient l'implication de la phospholipase D (PLD) dans la différenciation de myoblastes L6 en culture, induite par l'arginine-vasopressine (AVP). En réponse aux agonistes, la PLD hydrolyse la phosphatidylcholine des membranes cellulaires, donnant naissance à l'acide phosphatidique (PA), messager impliqué dans diverses fonctions. Nous avons cherché à définir le rôle de cette voie dans la différenciation des myoblastes L6. Nous avons caractérisé le système de la PLD dans ce modèle, et observé que son activation par l'AVP dépend de la médiation de la protéine G monomérique RhoA, dont l'implication dans la formation des fibres de stress et la myogénèse est reconnue. Les myoblastes expriment les deux isoformes connues de PLD, PLD1 et PLD2, et leur expression est différentiellement régulée au cours de la différenciation. L'inhibition pharmacologique de la production de PA bloque la différenciation. Inversement, la surexpression de l'isoforme PLD1, mais pas celle de l'isoforme PLD2, stimule la différenciation. Nous en déduisons que la PLD, et spécifiquement l'isoforme PLD1, est nécessaire à la myogénèse, conclusion confirmée par l'observation que l'ester de phorbol TPA est capable d'induire une activation soutenue de PLD et une différenciation myogénique complète. En réponse aux agents myogéniques AVP et TPA, nous avons observé la formation rapide de fibres de stress d'actine, et montré que cette formation est PLD-dépendante. Nous avons observé par immunofluorescence une translocation de PLD1 du Golgi vers les fibres de stress. A l'aide d'une sonde fluorescente sélective du PA, nous avons pu observer pour la première fois que ce messager est accumulé au niveau des fibres de stress naissantes. Ces résultats démontrent que PLD1 et PA sont directement impliqués dans le remodelage du cytosquelette lors de la stimulation myogénique. Un lien entre la production de PA par la PLD et la production de PIP2 par la PI4P-5-kinase étant reconnu, nous avons recherché et mis en évidence une synthèse PLD-dépendante de PIP2 lors de la stimulation myogénique. De plus, nous avons montré par immunofluorescence que le PIP2 est accumulé, comme le PA, au niveau des fibres de stress. Il apparaît donc que la PLD est impliquée dans les réarrangements de l'actine via la production de PIP2, dont le rôle dans la réorganisation du cytosquelette est prouvé. Il est admis que les réarrangements du cytosquelette jouent un rôle primordial dans la myogénèse. Nos résultats permettent de proposer l'hypothèse que PLD1 intervient dans ce processus en provoquant la formation PA- et PIP2-dépendante de fibres d'actine. Nous poursuivons ce travail en essayant de montrer que ces remaniements s'accompagnent d'une activation actine-dépendante de l'expression des gènes spécifiques du muscle, impliquant le facteur de transcription SRF "serum response factor".

  • Titre traduit

    Implication of phospholipase D1 and phosphatidic acid in myogenesis through interactions with actin cytoskeleton


  • Résumé

    Phospholipase D (PLD) hydrolyzes phosphatidylcholine of cell membranes in response to a variety of agonists, to generate phosphatidic acid (PA), a second messenger implicated in cellular functions such as vesicular trafficking and cytoskeletal reorganization. Because PLD is rapidly stimulated by Arg8-vasopressin (AVP), a potent inducer of myogenic differentiation in the myogenic rat cell line L6, we have investigated the role of this signaling pathway in myogenesis. We have first characterized the PLD system of L6 cells, and shown that AVP-induced PLD activation largely depends on the mediation of Rho, a small G-protein, known to be involved in both actin stress fiber formation and myogenic differentiation. The two isoforms PLD1 and PLD2 were both expressed in L6 undifferentiated myoblasts, but PLD1 was progressively down-regulated during the differentiation process whereas PLD2 expression remained constant. Inhibition of the AVP-dependent production of PA, either by brefeldin A or by 1-butanol, suppressed the expression of myogenin, a transcription factor essential for L6 differentiation, suggesting that PLD activity is required for myogenesis. The involvement of PLD in the myogenic response was confirmed by showing that ectopic PLD1overexpression significantly increased the number of cells entering the differentiation program. In further support to this notion, the phorbol ester TPA, at nanomolar concentrations, was able to both activate PLD and induce myogenic differentiation. Interestingly, AVP stimulation of L6 cells induced the formation of actin stress fibers. This response was selectively suppressed by 1-butanol, suggesting the involvement of PLD. This was confirmed by showing that propanolol, an inhibitor of PA metabolism which induces PA accumulation, was also able to induce stress fiber formation. Immunofluorescence staining of PLD1 after AVP stimulation localized the enzyme along the stress fibers. By using an intracellularly expressed PA-specific fluorescent probe, we showed that PA was accumulated at the level of actin fibers, further supporting the involvement of PLD activity in actin cytoskeleton remodelling. These results provide the first evidences for an important role of PLD1 and PA in myogenesis, and lead us to hypothesize that PLD regulates the myogenic process through its actions on actin cytoskeleton. Firstly, because cellular actin status is known to modulate gene expression through the activity of SRF transcription factor, we propose that PLD-dependent changes in actin fibers stimulate the expression of muscle-specific genes, including the myogenic key-player myogenin. Secondly, because stress fiber like structures present in differentiating myocytes are known to be involved in the early steps of myofibrillogenesis, we hypothesize that PLD might also promote myogenesis by enhancing the formation of myofibrils.

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Informations

  • Détails : 196 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 148-196

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  • Disponible pour le PEB
  • Cote : C.83(2856)
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