Etudes cristallographiques aux rayons X et aux neutrons du cytochrome P450cam et de la D-xylose isomerase

par Flora Meilleur

Thèse de doctorat en Physique

Sous la direction de Eva Pebay-Peyroula.

Soutenue en 2004

à l'Université Joseph Fourier (Grenoble) .

    mots clés mots clés


  • Résumé

    Les protons ont un rôle essentiel dans les mécanismes enzymatiques. Notre compréhension de ces processus peut donc grandement bénéficier de la localisation des hydrogènes aux sites actifs. Cette information peut-être obtenue par la cristallographie aux neutrons, aux résolutions modestes de 1. 5 - 2. 0 A. Cependant la cristallographie aux neutrons implique de nombreux challenges. De larges cristaux sont nécessaires pour palier aux faibles flux de neutrons disponibles. De plus, l'importante diffusion incohérente de l'hydrogène réduit considérablement le signal/bruit. Cela peut être contourné en deutérant l'échantillon, partiellement par trempage en solution deutérée ou complètement en produisant une protéine deutérée. La perdeutération offre un gain important en améliorant le signal/bruit d'un ordre de grandeur (permettant l'utilisation de cristaux plus petits) et en renforçant la visibilité des cartes neutroniques. Les cytochromes P450 sont impliqués dans de nombreux processus vitaux. Ils catalysent l'addition d'oxygène à des composés non-activés. La compréhension de leur mécanisme nécessite la connaissance de la position des hydrogènes au site actif. Pour bénéficier du gain offert par la perdeutération, le cytochrome P450cam perdeutéré a été produit. Son intégrité a été évaluée par FTIR et cristallographie aux rayons X. La D-xylose isomerase est une enzyme utilisée industriellement pour convertir la glucose en fructose. La structure neutronique de la D-xylose isomerase partiellement deutérée a été déterminée pour définir des détails critiques de son mécanisme enzymatique.


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  • Titre traduit

    Neutron and X-ray crystallographic analysis of Cytochrome P450cam and D-xylose isomerase


  • Résumé

    Protons play critical roles in the enzymatic mechanisms. Therefore, out understanding of these processes may greatly benefit from the localisation of hydrogens at the active sites. Information on hydrogen positions can be obtained from neutron crystallography at relatively modest resolutions of 1. 5-2. 0 A. However, neutron protein crystallography raises many challenges. Large crystals are requiered to compensate the weak flux of available neutron beams. Moreover, the large hydrogen incoherent scattering background significantly reduces the signal to noise. This problem can be overcome by deuterating the sample, either partially, by soaking crystals in deutreated mother liquor, or more fully, by preparing perdeuterated protein samples. Perdeuteration offers critical benefits in neutron diffraction experiments, providing a 10-fold gain in signal/noise (enabling smaller crystals to be used) and enhancing the visibility of deuterium atoms and water positions in the resulting maps. Cytochrome P450s are involved in many vital processes. They catalyse the addition of molecular oxygen to nonactivated hydrocarbons. The understanding of the mechanism of these enzymes requieres the knowledge of the molecular oxygen at the active site. In order to benefit from the gain offered by deuterium labelling, perdeuterated cytochrome P450cam was produced and crystallised. The integrity of the perdeuterated cytochrome was assessed by FTIR and X-ray crystallography. D-xylose isomerase is an enzyme industrially used to convert glucose into fructose. The neutron structure of partially deuterated D-xylose isomerase was determined in order to provide critical detail of its enztmatic mechanism.

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Informations

  • Détails : 196 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. en fin de chapitre

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  • Bibliothèque : Service interétablissements de Documentation (Saint-Martin d'Hères, Isère). Bibliothèque universitaire de Sciences.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : TS04/GRE1/0067
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  • Cote : TS04/GRE1/0067/D
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